Жаңылыктар

Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы чектелген CSS колдоосуна ээ.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Ал ортодо, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Активдештирилген эфирлерге же фенокси радикалдарына негизделген ферменттик жакындык белгилөө ыкмалары тирүү клеткалардагы субклеткалык протеомдорду жана белок интеракторлорун картага түшүрүү үчүн кеңири колдонулат.Бирок, активдештирилген эфирлер азыраак реактивдүү, натыйжада кенен белгилөө радиусу пайда болот жана пероксид менен дарылоо аркылуу пайда болгон фенокси радикалдары редокстук жолдорго тоскоол болушу мүмкүн.Бул жерде биз miniSOG фотосенсибилизатор протеинди кызыктырган протеинге генетикалык жактан байланыштыруу жолу менен иштелип чыккан жакындык белгилөөчү көз каранды фотоактивация (PDPL) ыкмасын билдиребиз.Көк жарык менен иштетилген жана экспозиция убактысы менен башкарылат, синглет кычкылтек түзүлөт жана андан кийин анилиндик зонд менен гистидин калдыктарынын мейкиндик-убактылуу түрдө чечилген маркировкасына жетишилет.Биз органелл-спецификалык протеомдун картасы аркылуу анын жогорку тактыгын көрсөтөбүз.PDPLди TurboID менен жанаша салыштыруу PDPLдин конкреттүү жана ар тараптуу протеомикалык камтылышын көрсөтөт.Андан кийин, биз PDPLди оору менен байланышкан транскрипциялык коактиватор BRD4 жана E3 Паркин лигазасына колдондук жана мурда белгисиз интеракторлорду таптык.Ашыкча экспрессияны скрининг аркылуу Паркин үчүн эки белгисиз субстрат, Ssu72 жана SNW1 аныкталган, алардын деградациясы ubiquitination-proteasome жолу менен шартталган.
Белок тармактарынын так мүнөздөмөсү көптөгөн негизги клеткалык процесстердин негизинде жатат.Демек, белоктун өз ара аракеттенүүсүнүн жогорку так мейкиндик-убакыт картасы биологиялык жолдорду, оорунун патологиясын чечмелөө үчүн жана бул өз ара аракеттенүүнү дарылоо максатында үзгүлтүккө учуратуу үчүн молекулярдык негизди түзөт.Ушул максатта тирүү клеткалардын же ткандардын убактылуу өз ара аракеттенүүсүн аныктоого жөндөмдүү методдор абдан керектүү.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) тарыхый жактан кызыктырган белоктордун (POIs) милдеттүү өнөктөштөрүн аныктоо үчүн колдонулган.Сандык протеомика ыкмаларын иштеп чыгуу менен Bioplex3.0 түзүлдү, AP-MS негизиндеги белок тармактарынын эң чоң маалымат базасы.AP-MS абдан күчтүү болгонуна карабастан, клетка лизиси жана иш процессиндеги суюлтуу кадамдары алсыз жана убактылуу байланыштыруучу өз ара аракеттенүүгө багытталган жана лизиске чейин бөлүктөргө бөлүнбөгөн жалган өз ара жуптар сыяктуу пост-лизис артефакттарын киргизет.
Бул маселелерди чечүү үчүн кайчылаш топтору жана ферменттик жакын этикеткалоо (PL) платформалары (мисалы, APEX жана BioID)5 менен табигый эмес аминокислоталар (UAA) иштелип чыккан.UAA ыкмасы көптөгөн сценарийлерде ийгиликтүү колдонулуп, түз протеин чаптамалары жөнүндө маалымат менен камсыз кылынса да, UAA киргизүү сайтын оптималдаштыруу дагы эле талап кылынат.Андан да маанилүүсү, бул энбелгилөө окуяларынын каталитикалык өзгөрүүсү жок стехиометриялык этикеткалоо ыкмасы.Ал эми, BioID ыкмасы сыяктуу ферменттик PL методдору инженердик биотин лигазасын POI7ге бириктирет, ал кийин биотинди активдештирип, реактивдүү биотинил-АМФ эфир аралыгын пайда кылат.Ошентип, фермент проксималдык лизин калдыктарын белгилөөчү активдештирилген биотинди "булутту" катализдейт жана бошотот.Бирок BioID жетиштүү белгиленген сигналды алуу үчүн 12 сааттан ашык убакытты талап кылат, бул аны убактылуу чечмелөө менен колдонууга жол бербейт.Ачыткы дисплейге негизделген багытталган эволюцияны колдонуу менен, TurboID BioIDдин негизинде 10 мүнөттүн ичинде биотин менен эффективдүү маркировкалоого мүмкүндүк берип, динамикалык процесстерди изилдөөгө мүмкүндүк берип, натыйжалуураак болушу үчүн иштелип чыккан.TurboID өтө активдүү болгондуктан жана эндогендик биотиндин деңгээли төмөн деңгээлдеги этикеткалоо үчүн жетиштүү болгондуктан, экзогендик биотинди кошуу менен өтө өркүндөтүлгөн жана убакыттын белгиленген этикеткалоо талап кылынганда, фондо белгилөө потенциалдуу көйгөйгө айланат.Кошумчалай кетсек, активдештирилген эфирлер начар реактивдүү (t1/2 ~5 мин), бул чоң этикеткалоо радиусуна алып келиши мүмкүн, айрыкча кошуна белоктор биотин менен каныккандан кийин 5. Башка ыкмада инженердик аскорбат пероксидазасынын генетикалык биригүүсү (б.а. биотин- фенол радикалдарын жана протеинди бир мүнөттүн ичинде маркировкалоого мүмкүндүк берет9,10. APEX субклеткалык протеомаларды, мембраналык белок комплекстерин жана цитозолдук сигнал берүүчү протеин комплекстерин11,12 аныктоо үчүн кеңири колдонулат.Бирок пероксиддердин жогорку концентрациясына болгон муктаждык редокстук протеиндерге же жолдорго таасир этиши мүмкүн. клеткалык процесстер.
Ошентип, уюлдук жолдорду олуттуу бузбай туруп, жогорку мейкиндик жана убакыттык тактык менен реактивдүү энбелгиленген радиустук басуу түрлөрүн түзүүгө жөндөмдүү жаңы ыкма учурдагы методдорго маанилүү кошумча болуп калат. Реактивдүү түрлөрдүн ичинен синглет кычкылтек өзүнүн кыска өмүрү жана чектелген диффузиялык радиусу (клеткаларда t1/2 < 0,6 мкс)13 болгондуктан биздин көңүлүбүздү бурган. Реактивдүү түрлөрдүн ичинен синглет кычкылтек өзүнүн кыска өмүрү жана чектелген диффузиялык радиусу (клеткаларда t1/2 < 0,6 мкс)13 болгондуктан биздин көңүлүбүздү бурган. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни жана ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Активдүү формалардын ичинен синглет кычкылтек өзүнүн кыска өмүрү жана чектелген диффузиялык радиусу (клеткаларда t1/2 < 0,6 мкс) 13 үчүн көңүлүбүздү бурду.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs 中t1/2 1/2 < 0,6 μs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни жана ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Активдүү формалардын ичинен синглет кычкылтек өзүнүн кыска өмүрү жана чектелген диффузиялык радиусу (клеткаларда t1/2 < 0,6 мкс) болгондуктан биздин көңүлүбүздү бурат.Синглет кычкылтек метионинди, тирозинди, гистидинди жана триптофанды туш келди кычкылдандырып, амин же тиолдун негизиндеги зонддорго кошулуу үчүн полярдуу 14,15 кылат16,17.Синглет кычкылтек субклеткалык бөлүмдүн РНКсын белгилөө үчүн колдонулса да, эндогендик POI жакындык маркерлерин кайра иштетүү стратегиялары изилденбеген бойдон калууда.Бул жерде биз фотоактивацияга көз каранды жакындык энбелгиси (PDPL) деп аталган платформаны сунуштайбыз, анда биз miniSOG фотосенсибилизатору менен бириктирилген POIлерди жарыктандыруу үчүн көк жарыкты колдонобуз жана проксималдык калдыктарды кычкылдандыруу үчүн синглет кычкылтектин пайда болушун, андан кийин химиялык зонддорду кычкылдандыруу үчүн амин камтыган модификацияларды колдонобуз. ортоңку тирүү клеткалар..Тегдин өзгөчөлүгүн жогорулатуу үчүн химиялык зонддордун тобун сынап көрдүк жана ачык протеомика иш агымын колдонуу менен өзгөртүү сайттарын аныктадык.PDPLди TurboID менен жанаша салыштыруу PDPLдин конкреттүү жана ар тараптуу протеомикалык камтылышын көрсөтөт.Биз бул ыкманы субклеткалык протеомдун органелл-спецификалык маркерлерине жана жалпы протеомдун рак менен байланышкан эпигенетикалык жөнгө салуучу протеин BRD4 жана Паркинсон оорусу менен байланышкан E3 лигаза Паркин үчүн байланыштыруучу өнөктөштөрдү аныктоого колдондук, бул белоктордун белгилүү жана белгисиз тармагын тастыктады. өз ара аракеттенүүлөр..PDPLдин чоң протеиндик комплекстерде E3 субстраттарын таануу жөндөмү кыйыр байланыштыргычтарды таануу талап кылынган жагдайды билдирет.Ubiquitination-proteasome ортомчулук кылган эки белгисиз паркин субстраты in situ тастыкталды.
Фотодинамикалык терапия (PDT)19 жана хромофордун жардамы менен лазердик инактивациялоо (CALI)20, мында фотосенсибилизаторлор менен жарык нурлануу синглет кычкылтекти пайда кылат, максаттуу белокторду инактивациялоо же клетканын өлүмүнө алып келиши мүмкүн.Синглет кычкылтек теориялык диффузиялык аралыгы болжол менен 70 нм болгон жогорку реактивдүү зат болгондуктан, фотосенсибилизатордун айланасында мейкиндикте чектелген кычкылданууну башкарууга болот.Бул концепциянын негизинде, биз тирүү клеткалардагы белок комплекстерин жакын этикеткалоо үчүн синглет кычкылтекти колдонууну чечтик.Биз төрт функцияны аткаруу үчүн PDPL химопротеомикалык ыкмасын иштеп чыктык: (1) PL энзимдик ыкмага окшош активдүү синглет кычкылтектин генерациясын катализдөө үчүн;(2) жарыктын башталышы боюнча убакытты чечүүчү этикеткалоону камсыз кылуу;(3) өзгөртүү жолу менен (4) Фонду азайтуу үчүн эндогендик кофакторлорду (мисалы, биотин) колдонуудан качыңыз же айлана-чөйрөнүн стрессине клетканын таасирин азайтуу үчүн өтө кооптуу экзогендик реагенттерди (мисалы, пероксиддерди) колдонуңуз.
Фотосенсибилизаторлорду эки категорияга бөлүүгө болот, анын ичинде кичинекей молекулярдык флюорофорлор (мисалы, роза бенгал, метилен көк)22 жана генетикалык жактан коддолгон майда белоктор (мисалы, miniSOG, KillerRed)23.Модулдук дизайнга жетүү үчүн, биз POI24,25ке фотосенсибилизатор (PS) белокторун кошуу менен биринчи муундагы PDPL платформасын иштеп чыктык (Figure 1a).Көк жарык менен нурланганда, синглет кычкылтек проксималдык нуклеофилдик аминокислота калдыктарын кычкылдандырат, натыйжада электрофилдүү болгон umpolung полярдуулук пайда болот жана андан ары амин зондунун нуклеофилдери менен реакцияга киришет16,17.Зонд LC/MS/MS мүнөздөмөсү үчүн чыкылдатуу химиясын жана ылдый тартуу үчүн алкин туткасы менен иштелип чыккан.
miniSOG ортомчулугу менен белок комплекстерин маркировкалоонун схемалык иллюстрациясы.Көк жарыкка дуушар болгондо, miniSOG-POI туюндурган клеткалар синглет кычкылтек жаратат, ал өз ара аракеттенүүчү протеиндерди өзгөртөт, бирок байланышпаган белокторду эмес.Фотооксиданттын аралык продуктулары коваленттик кошулмаларды пайда кылуу үчүн амин-химиялык зонддун релелик белгилери менен кармалат.Химия зондундагы алкинил тобу химияны ылдый түшүрүү жолу менен байытууга, андан кийин LC-MS/MS санын аныктоого мүмкүндүк берет.b Аминдик зонддордун химиялык түзүлүшү 1-4.с Өкүл флуоресценттик гел анализи митохондриялык локализацияланган miniSOG ортомчу протеомдук маркерлерди 1-4 жана гел денситометриясынын негизинде салыштырмалуу сандык аныктоону колдонуу менен.Химиялык зонддордун сигнал-фондук катышы көк жарыкты кошпогондо терс башкаруу эксперименттерин колдонуу менен же miniSOG туюнтмасы жок HEK293T клеткаларын колдонуу менен бааланган.n = 2 биологиялык көз карандысыз үлгүлөр.Ар бир чекит биологиялык репликаны билдирет.d Көрсөтүлгөн PDPL компоненттери бар же жок болгон учурда оптималдаштырылган 3 зонддун жардамы менен өкүлдүн аныктоосу жана сандык аныктоосу c.n = 3 биологиялык көз карандысыз үлгүлөр.Ар бир чекит биологиялык репликаны билдирет.Орто сызыктар жана муруттар орточо жана ± стандарттык четтөөнү билдирет.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Алыскы кызыл Si-DMA тагы менен синглет кычкылтектин конфокалдык сүрөтү.Масштаб тилкеси: 10 мкм.Гель сүрөттөө жана конфокалдык эксперименттер өз алдынча, жок эле дегенде, эки жолу окшош натыйжалар менен кайталанган.
Биз алгач HEK293Tде туруктуу түрдө көрсөтүлгөн miniSOG26 жана KillerRed23 жетилген фотосенсибилизаторлорунун химиялык зонд катары протеомдун пропаргиламин маркалоосуна ортомчулук кылуу жөндөмүн сынап көрдүк (Кошумча сүрөт 1a).Гель флуоресценттик анализи көрсөткөндөй, бүтүндөй протеомдун этикеткалоосуна miniSOG жана көк жарык нурлануу аркылуу жетишилген, ал эми KillerRed менен эч кандай көрүнүүчү этикеткалоочу продукт байкалган эмес.Сигнал-фон катышын жакшыртуу үчүн, биз андан кийин анилинди (1 жана 3), пропиламини (2) же бензиламинди (4) камтыган химиялык зонддорду сынап көрдүк.Биз HEK293T клеткалар өздөрү, балким, эндогендик riboflavin photosensitizer, flavin mononucleotide (FMN) 27 үчүн, эч кандай көк жарык салыштырганда жогорку өбөлгөлөрү сигнал бар экенин байкадык. Анилинге негизделген 1 жана 3 химиялык зонддор жакшыраак өзгөчөлүк берди, HEK293T митохондриядагы miniSOGди туруктуу экспрессиялап, 3-зонд үчүн сигналдын >8 эсеге көбөйүшүн көрсөтөт, ал эми 2-зонд РНК-белгилөө методунда CAP-seq ~2,5-ти гана көрсөтөт. РНК менен протеиндин ортосундагы реактивдүүлүктүн ар кандай артыкчылыктарынан улам бүктөлгөн сигналдын жогорулашы (сүрөт 1b, c). Анилинге негизделген 1 жана 3 химиялык зонддор жакшыраак өзгөчөлүк берди, HEK293T митохондриядагы miniSOGди туруктуу экспрессиялап, 3-зонд үчүн сигналдын >8 эсеге көбөйүшүн көрсөтөт, ал эми 2-зонд РНК-белгилөө методунда CAP-seq ~2,5-ти гана көрсөтөт. РНК менен протеиндин ортосундагы реактивдүүлүктүн ар кандай артыкчылыктарынан улам бүктөлгөн сигналдын жогорулашы (сүрөт 1b, c).Анилинге негизделген 1 жана 3 химиялык зонддор жакшыраак өзгөчөлүк көрсөттү: митохондриядагы miniSOGди туруктуу туюндурган HEK293T 3-зонд үчүн сигналдын 8 эседен ашык көбөйүшүн көрсөтөт, ал эми 2-зонд, CAP-seq РНК этикеткалоо методунда колдонулган, бир гана РНК менен белоктун ортосундагы реактивдүүлүктүн ар кандай артыкчылыктарынан улам сигналдын ~2,5 эсе көбөйүшүн көрсөтөт (сүрөт 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 具有 好 的 的, hek293t 在 线 粒体 中 稳定 表达 Minisog, 探针 3 的 信号信号 增加> 8 倍, 而 而 用 于 8 标记 方法 Cap-Seq 的 探针 2 仅 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）基于 苯胺 的 化学 探针 探针 1 和 3 具有 更 的, hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 Minisog, 探针 3 的 信号 于 增加> 8 倍 倍 而 于 于 8 倍 Cap-Eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~5 -倍信号增加，可能是由于RNAАнилинге негизделген 1 жана 3-химиялык зонддор жакшыраак өзгөчөлүккө ээ болгон, HEK293T митохондриядагы miniSOGди туруктуу чагылдырган, ал эми 3-зонддо сигнал 8 эседен ашык көбөйгөн, ал эми CAP-seq РНК маркалоо ыкмасы үчүн 2-зонд ~ 2,5 эсе гана өскөн.сигналда, балким, РНК менен протеиндин ортосундагы реакциянын ар кандай артыкчылыктарына байланыштуу (сүр. 1b, в).Мындан тышкары, зонд 3 изомерлери жана гидразиндик зонддор (5, 6, 7 зонддору) сыналып, 3-зонддун оптималдаштырылышын ырастады (Кошумча 1b,c сүрөт).Ошо сыяктуу эле, гелдин ичиндеги флуоресценттик анализ башка оптималдаштырылган эксперименталдык параметрлерди аныктады: нурлануунун толкун узундугу (460 нм), химиялык зонд концентрациясы (1 мМ) жана нурлануу убактысы (20 мүнөт) (Кошумча сүрөт 2a–c).PDPL протоколундагы кандайдыр бир компонентти же кадамды өткөрүп жиберүү сигналдын фонго олуттуу өзгөрүшүнө алып келди (сүрөт 1d).Белгилүү болгондой, протеиндин этикеткалоо синглет кычкылтекти өчүрүү үчүн белгилүү болгон натрий азидинин же тролокстун катышуусунда бир топ кыскарган.Singlet кычкылтекти турукташтыруу үчүн белгилүү болгон D2O болушу этикеткалоо сигналын күчөтөт.Башка реактивдүү кычкылтек түрлөрүнүн этикеткалоого кошкон салымын изилдөө үчүн гидроксил жана супероксиддик радикалдарды тазалоо үчүн маннитол жана С витамини кошулган, тиешелүүлүгүнө жараша, 18, 29, бирок алар этикеткалоону азайтуу үчүн табылган эмес.H2O2 кошуу, бирок жарыктандыруу эмес, этикеткалоого алып келген жок (Кошумча сүрөт 3a).Si-DMA зонддору менен флуоресценттик синглет кычкылтек сүрөтү HEK293T-miniSOG зымында синглет кычкылтектин бар экенин тастыктады, бирок баштапкы HEK293T зымында эмес.Мындан тышкары, mitoSOX Red жарыктан кийин супероксид өндүрүшүн аныктай алган жок (1e-сүрөт жана кошумча 3б-сүрөт) 30. Бул маалыматтар синглет кычкылтек кийинки протеомикалык белгилөө үчүн жооптуу негизги реактивдүү кычкылтек түрү экенин так көрсөтүп турат.PDPLдин цитотоксиктиги бааланган, анын ичинде көк жарык нурлануусу жана химиялык зонддор жана олуттуу цитотоксиктүүлүк байкалган эмес (Кошумча 4а сүрөт).
Маркировка механизмин изилдөө жана LC-MS/MS аркылуу протеиндик комплекстердин протеомикалык идентификациясын иштетүү үчүн, биз адегенде кайсы аминокислоталар өзгөртүлгөнүн жана зонд этикеткаларынын дельта массасын аныкташыбыз керек.Метионин, гистидин, триптофан жана тирозин синглет кычкылтек14,15 менен өзгөртүлгөнү кабарланган.Биз TOP-ABPP31 иш процессин MSFragger32 негизиндеги FragPipe эсептөө платформасы тарабынан берилген калыс ачык издөө менен бириктиребиз.Синглет кычкылтек модификациясы жана химиялык зонд этикеткалоодон кийин, кливавидинди камтыган биотинди азайтуу энбелгисин колдонуу менен чыкылдатуу химиясы аткарылды, андан кийин нейтравидиндин созулушу жана трипсинди сиңирүү.Модификацияланган пептид, дагы эле чайырга байланып, LC-MS/MS анализи үчүн фотокливацияланган (Figure 2a жана Кошумча маалыматтар 1).50дөн ашык пептиддик карта (PSM) матчтары тизмеленген (сүрөт 2б) менен протеомдун ичинде көп сандагы өзгөртүүлөр болгон.Таң калыштуусу, биз гистидиндин модификациясын гана байкадык, кыязы, кычкылданган гистидиндин башка аминокислоталарга караганда анилиндик зонддорго карата жогорку реактивдүүлүгүнө байланыштуу.Гистидиндин синглет кычкылтек менен кычкылданышынын жарыяланган механизмине ылайык, 21,33 сунушталган дельта-массалык структурасы +229 Да эки кычкылдануудан кийин 3-зонддун 2-оксо-гистидин менен кошулуусуна туура келет, ал эми +247 Да гидролиз продуктусу болуп саналат. +229 Da (Кошумча 5-сүрөт).MS2 спектрин баалоо y жана b иондорунун көпчүлүгүн, анын ичинде модификацияланган фрагмент иондорун (y жана b) идентификациялоонун жогорку ишенимдүүлүгүн көрсөттү (сүрөт 2c).PDPL-модификацияланган гистидиндердин жергиликтүү ырааттуулугун контексттик талдоо ±1 позицияларындагы майда гидрофобдук калдыктар үчүн орточо мотивдик артыкчылыкты көрсөттү (Кошумча сүрөт 4b).Орточо алганда, ар бир протеинге 1,4 гистидин аныкталган жана бул маркерлердин жерлери эриткичтерге жеткиликтүү беттин аянты (SASA) жана салыштырмалуу эриткичтин жеткиликтүүлүгү (RSA) анализи менен аныкталган (Кошумча 4c,d сүрөт).
MSFragger тарабынан иштетилген FragPipe эсептөө платформасын колдонуу менен калдык тандоону изилдөө үчүн калыс иш процесси.Стрептавидин чайырынан модификацияланган пептиддердин фотобөлүнүшүнө мүмкүндүк берүү үчүн Клик химиясында бөлүнүүчү шилтемелер колдонулат.Көптөгөн өзгөртүүлөрдү, ошондой эле тиешелүү калдыктарды аныктоо үчүн ачык издөө башталды.б Протеомдо болгон модификациялардын массасын дайындаңыз.Пептиддик карта PSM.c 3-зонд менен модификацияланган гистидин участокторунун MS2 спектралдык аннотациясы. Мисал катары, 3-зонд менен коваленттик реакция модификацияланган аминокислотага +229,0938 Да кошулду.d Мутация анализи PDPL маркерлерин текшерүү үчүн колдонулат.PRDX3 (H155A, H225A) жана PRDX1 (H10A, H81A, H169A) анти-Флаг аныктоо үчүн жапайы типтеги плазмидалар менен трансфекцияланган.e Синтетикалык пептид 3 зондунун катышуусунда тазаланган miniSOG менен реакцияга кирди жана Δm +247 жана +229 менен тиешелүү продуктулар LC-MS спектринде белгиленди.f In vitro протеин менен протеиндин өз ара аракеттешүүсү miniSOG-6xHis-теги жана анти-6xHis антителолору менен моделдешти.Антибиотин (стрептавидин-HRP) жана чычканга каршы Вест-блоттун анализи miniSOG-6xHis/anti-6xHis антитело комплекстеринин жарыкка тийүү убактысына жараша 3-зонд менен белгиленген.Жеке белоктордун этикеткалары тиешелүү молекулярдык салмакта көрсөтүлөт: LC антитело жеңил чынжыр, HC антитело оор чынжыр.Бул эксперименттер окшош натыйжалар менен өз алдынча жок дегенде эки жолу кайталанган.
Маркировкалоочу жерди биохимиялык текшерүү үчүн масс-спектрометрия менен аныкталган PRDX3 жана PRDX1 гистидинден аланинге өзгөртүлдү жана трансфекциялык анализдердин жапайы түрүнө салыштырылды.PDPL натыйжалары мутация этикеткалоону кыйла азайтканын көрсөттү (сүрөт 2d).Ошол эле учурда, ачык издөөдө аныкталган пептиддик тизмектер синтезделди жана LC-MS тарабынан аныкталганда, 3-зонддун жана көк жарыктын катышуусунда тазаланган miniSOG менен in vitro реакциясына кирди, LC-MS тарабынан табылганда массасы +247 жана +229 Да болгон продуктыларды берди (сүрөт 1). 2e).).Өз ара аракеттенүүчү проксималдык протеиндерди miniSOG фотоактивациясына жооп катары in vitro белгилөө мүмкүнбү же жокпу, текшерүү үчүн, биз miniSOG-6xHis протеининин жана анын анти-моноклоналдык антителосунун in vitro ортосундагы өз ара аракеттенүү аркылуу жасалма жакындык анализин иштеп чыктык (Figure 2f).Бул анализде биз miniSOG менен антителолордун оор жана жеңил чынжырларынын проксималдык белгилөөсүн күттүк.Чынында, анти-чычкан (анти-6xHis-белгиленген антитело оор жана жеңил чынжыр таануу) жана streptavidin Western blots оор жана жеңил чынжырлардын күчтүү biotinylation көрсөттү.Баса, биз 6xHis теги жана жеңил жана оор чынжырлардын ортосундагы кайчылаш байланыштар үчүн miniSOG автобиотиниляциясын байкадык, бул лизин менен 2-оксо-гистидин проксималдык реакциясынын ортосундагы мурда сүрөттөлгөн боштукка байланыштуу болушу мүмкүн.Жыйынтыктап айтканда, биз PDPL гистидинди жакындыкка жараша өзгөртөт деген жыйынтыкка келебиз.
Биздин кийинки максат in situ белгилөө өзгөчөлүгүн текшерүү үчүн субклеткалык протеомду мүнөздөп берүү болду.Ошондуктан, биз HEK293T клеткаларынын ядросунда, митохондриялык матрицасында же тышкы ER мембранасында туруктуу miniSOG туюндурдук (сүрөт 3a).Гель флуоресценттик анализи үч субклеткалык жерде, ошондой эле ар кандай этикеткалоо үлгүлөрүндө көп белгиленген тилкелерди көрсөттү (сүрөт 3b).Fluorescence сүрөт талдоо PDPL жогорку өзгөчөлүгүн көрсөттү (сүрөт. 3c).PDPL иштөө процессинен кийин флуоресценттик микроскопиянын жардамы менен субклеткалык протеомаларды аныктоо үчүн родамин боёктору менен чыкылдатуу реакциялары жүргүзүлдү жана PDPL сигналдары DAPI, митохондриялык трекерлер же ER трекерлери менен коллокализацияланды, бул PDPLдин жогорку ишенимдүүлүгүн тастыктады.Үч органелл жерлери үчүн, PDPL менен TurboIDди avidin western blot аркылуу жанаша салыштыруу, PDPL алардын тиешелүү башкаруу органдарына салыштырмалуу өзгөчө белгиленгенин көрсөттү.PDPL шарттарында, көбүрөөк белгиленген тилкелер пайда болуп, көбүрөөк PDPL-белгиленген белокторду көрсөттү (Кошумча сүрөт 6a-d).
miniSOG ортомчу органелл-спецификалык протеомдорду белгилөөнүн схемалык өкүлчүлүгү.miniSOG митохондриялык матрицаны адамдын COX4 (mito-miniSOG) N-терминал 23 аминокислоталарына, ядрону H2Bге (ядро-miniSOG) жана ER мембранасынын цитоплазмалык тарабы (ER-miniSOG) аркылуу Sec61β менен бириктирүү аркылуу бутага алат. ).Көрсөтмөлөргө гель сүрөттөө, конфокалдык сүрөттөө жана масс-спектрометрия кирет.б Үч органелл-спецификалык PDPL профилдердин өкүлү гел сүрөттөрү.CBB Coomassie Brilliant Blue.c HEK293T клеткаларынын өкүлү конфокалдык сүрөттөрү V5 (кызыл) деп белгиленген антитело тарабынан аныкталган ар кандай субклеткалык локализациялар менен miniSOG туруктуу экспрессия.Subcellular маркерлер митохондрия жана ER (жашыл) үчүн колдонулат.PDPL иш процесси Cy3-азиддик клик химиясын колдонуу менен miniSOG (сары) белгиленген субклеткалык протеомаларды аныктоону камтыйт.Масштаб тилкеси: 10 μm.d Белгисиз сандык аныктоо (n = 3 көз карандысыз биологиялык эксперименттер) менен сандык ар кандай органеллдердеги PDPL тегиндеги протеомдордун вулкандык сюжеттери.Эки куйруктуу Студенттин t-сынагы жанар тоо участокторунда колдонулган.HEK293T жапайы түрү терс башкаруу катары колдонулган. Олуттуу өзгөргөн белоктор кызыл түс менен белгиленет (p <0,05 жана >2 эселенген иондун интенсивдүүлүгүнүн айырмасы). Олуттуу өзгөргөн белоктор кызыл түс менен белгиленет (p <0,05 жана >2 эселенген иондун интенсивдүүлүгүнүн айырмасы). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 жана >2-кратная разница в интенсивности ионов). Олуттуу өзгөртүлгөн белоктор кызыл түс менен белгиленет (п <0,05 жана иондун интенсивдүүлүгүндөгү >2 эсе айырма).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Олуттуу өзгөргөн белоктор кызыл түс менен белгиленет (п <0,05 жана > иондук күчтүн 2 эсе айырмасы).HEK293T-miniSOG үчүн маанилүү, бирок HEK293T үчүн маанилүү эмес протеиндер жашыл түстө көрсөтүлгөн.e Эксперименттерден алынган протеомикалык маалымат топтомдорунун өзгөчөлүгүн талдоо г.Ар бир органеллдеги (кызыл жана жашыл чекиттер) статистикалык маанилүү белоктордун жалпы саны жогоруда белгиленген.Гистограммалар MitoCarta 3.0, GO анализинин негизинде органеллдерде локализацияланган белокторду көрсөтөт жана A. Ting et al.адамдар.Митохондриялар, ядролор жана ER үчүн өзүнчө маалымат топтомдору.Бул эксперименттер окшош натыйжалар менен өз алдынча жок дегенде эки жолу кайталанган.Чийки маалыматтар чийки маалымат файлдары түрүндө берилет.
Гель жана сүрөттөө натыйжалары менен шыктанган, этикеткасыз сандык аныктоо ар бир органеллде аныкталган протеомдун санын аныктоо үчүн колдонулган (Кошумча маалыматтар 2).Трансфекцияланбаган HEK293T фон маркерлерин алып салуу үчүн терс башкаруу катары колдонулган. Вулкандын сюжеттик анализи олуттуу байытылган белокторду (р <0,05 жана >2 эселенген иондун интенсивдүүлүгү) жана miniSOG-экспрессиялоочу сызыктарда гана бар синглондук протеиндерди көрсөттү (сүрөт 3d кызыл жана жашыл чекиттер). Вулкандын сюжеттик анализи олуттуу байытылган белокторду (р <0,05 жана >2 эселенген иондун интенсивдүүлүгү) жана miniSOG-экспрессиялоочу сызыктарда гана бар синглондук протеиндерди көрсөттү (сүрөт 3d кызыл жана жашыл чекиттер). Анализ графика вулкана показал значительно обогощенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG, зеленический только. Volcano участогун талдоо бир кыйла байытылган белокторду көрсөттү (р <0,05 жана > 2 эсе ион интенсивдүүлүгү), ошондой эле бир гана белоктор miniSOG-экспрессия сызыктар (сүрөт. 3d, кызыл жана жашыл чекиттер).Л л л л лЛ л л л л л Анализ графика вулкана выявил значительно обогощенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отделные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Вулкан участогун талдоо кыйла байытылган белокторду (р <0,05 жана > 2x иондук күч), ошондой эле miniSOG экспрессия сызыгында гана болгон бир белокторду (3d-сүрөттө кызыл жана жашыл чекиттер) көрсөттү.Бул маалыматтарды бириктирип, биз тиешелүүлүгүнө жараша 1364, 461 жана 911 статистикалык маанилүү ядролук, митохондриялык жана ER сырткы мембраналык белокторду аныктадык.органеллдер-локалдаштырылган PDPL тактыгын талдоо үчүн, биз MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) талдоо жана A. Ting et al.73,4, 78,5 жана 73,0% тактыкка туура келген аныкталган белоктордун органеллдик өзгөчөлүгүн текшерүү үчүн митохондрия, ядро ​​жана ER үчүн маалымат топтому8 колдонулган (сүрөт 3e).PDPL өзгөчөлүгү PDPL органелл-спецификалык протеомаларды аныктоо үчүн идеалдуу курал экенин тастыктайт.Белгилей кетчү нерсе, аныкталган митохондриялык белоктордун субмитохондриялык анализи кармалган протеом негизинен матрицада жана ички мембранада (тиешелүүлүгүнө жараша 226 жана 106) бөлүштүрүлгөнүн көрсөттү, бул аныкталган митохондриялык белоктордун жалпы санынын 91,7% (362) түзөт.PDPLдин жогорку деңгээли кошумча тастыкталды (Кошумча сүрөт 7a).Ошо сыяктуу эле, субнуклеардык анализ басып алынган протеома негизинен ядродо, нуклеоплазмада жана ядродо таралганын көрсөттү (Кошумча фиг. 7b).Ядролук локализация сигналынын пептидинин (3xNLS) менен өзөктүк протеомикалык анализи H2B конструкциясына окшош тактыкты көрсөттү (Кошумча сүрөт 7c-h).PDPL маркеринин өзгөчөлүгүн аныктоо үчүн, ядролук ламинин А дискреттүү локализацияланган POI7 тузак катары тандалган.PDPL 36 кыйла байытылган белокторду аныктады, анын ичинен 12 протеин (30,0% анын ичинде ламин А) жакшы мүнөздөлгөн ламин А өз ара аракеттенүүчү протеиндер болгон, Стринг маалымат базасы тарабынан аннотацияланган, BioID ыкмасына (122 белок) караганда көбүрөөк пайыз менен 28. , 22.9 %) 7. Биздин метод азыраак белокторду аныктады, балким, чектелген маркировкалоо аймактарынан улам, бул көбүрөөк активдүү синглет кычкылтекинин жардамы менен мүмкүн болду.GO анализи аныкталган белоктор негизинен нуклеоплазмада (26), ядролук мембранада (10), ядролук мембранада (9) жана ядролук тешикчелерде (5) жайгашканын көрсөттү.Жалпысынан бул ядролук локализацияланган протеиндер байытылган протеиндердин 80% ын түзүп, андан ары PDPL өзгөчөлүгүн көрсөтүп турат (Кошумча сүрөт 8a–d).
PDPLдин органеллдерде жакындык белгисин жүргүзүү жөндөмдүүлүгүн аныктагандан кийин, биз PDPL POI милдеттүү өнөктөштөрдү талдоо үчүн колдонулушу мүмкүнбү же жокпу, сынап көрдүк.Атап айтканда, биз цитозолдук протеиндердин PDPL анализин аныктоого аракет кылдык, алар алардын жогорку динамикалык табиятынан улам мембраналык локализацияланган кесиптештерине караганда татаалыраак максаттуу болуп эсептелет.bromodomain жана extraterminal (BET) белок BRD4 ар кандай оорулар 35, 36 анын негизги ролу үчүн биздин көңүл бурган.BRD4 тарабынан түзүлгөн комплекс транскрипциялык коактиватор жана маанилүү терапиялык максат болуп саналат.c-myc жана Wnt5a транскрипция факторлорунун экспрессиясын жөнгө салуу менен, BRD4 курч миелоиддик лейкоздун (AML), көп миеломанын, Буркитттин лимфомасынын, жоон ичегинин рагы жана сезгенүү оорулары37,38 негизги детерминант болуп эсептелет.Кошумчалай кетсек, кээ бир вирустар папилломавирус, ВИЧ жана SARS-CoV-236,39 сыяктуу вирустук жана клеткалык транскрипцияны жөнгө салуу үчүн BRD4ти бутага алышат.
PDPL аркылуу BRD4 өз ара аракеттенүүсүнүн картасын түзүү үчүн, биз miniSOG менен BRD4 кыска N- же C-терминал изоформасын бириктирдик.Протеомикалык натыйжалар эки конструкциянын жогорку даражадагы дал келүүсүн көрсөттү (Кошумча сүрөт 9a).miniSOG-H2B менен аныкталган ядролук протеом BRD4 менен өз ара аракеттенген белоктордун 77,6% камтыйт (Кошумча сүрөт 9b).Андан кийин, жарыктын ар кандай убакыттары (2, 5, 10, 20 мин) маркер радиусун тууралоо үчүн колдонулган (сүрөт 4а жана кошумча маалыматтар 3).Биз кыскараак фотопериоддордо PDPL биринчи кезекте түздөн-түз байланыштыруучу өнөктөштөрдү белгилейт, ал эми узак мөөнөттөр кыскараак фотоактивация мезгилдери аныкталган белокторду, ошондой эле этикеткалоо комплекстериндеги кыйыр максаттарды камтыйт деген жыйынтыкка келдик.Чынында, биз чектеш убакыт чекиттеринин (84,6% 2 жана 5 мүнөткө; 87,7% 5 жана 10 мүнөткө; 98,7% 10 жана 20 мүнөткө) ортосунда күчтүү дал келүүнү таптык (сүрөт 4b жана кошумча сүрөт 9c).Бардык эксперименталдык топтордо биз BRD4 өзүн-өзү белгилөө гана эмес, сап базасында аннотацияланган MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A жана HMGB1 сыяктуу бир нече белгилүү максаттарды таптык.Бул буталардын иондук күчү экспозиция убактысына пропорционалдуу (сүрөт 4c жана кошумча сүрөт 9d).2 мүнөттүк топто аныкталган белоктордун GO анализи аныкталган белоктор ядродо локализацияланганын жана хроматинди кайра курууга жана РНК полимераза функциясына катышканын көрсөттү.белоктун молекулярдык милдети BRD4 милдети (сүрөт. 4d) менен шайкеш, хроматин милдеттүү же транскрипциялык coactivation байытылган.Стринг маалымат базасын иштеткен протеиндердин өз ара аракеттенүүсүн талдоо BRD4 жана HDAC менен байланыштыруучу ацетилденген гистондорго ылайыктуу SIN3A, NCOR2, BCOR жана SAP130 (сүр. 4e жана кошумча фиг. 9e) сыяктуу BRD4 менен HDAC үй-бүлөсүнүн өз ара аракеттенүүчү комплекстеринин ортосундагы кыйыр өз ара аракеттенүүнүн биринчи деңгээлин аныктады. ..Мындан тышкары, LC-MS / MS тарабынан аныкталган өкүл максаттары, анын ичинде Sin3A, NSUN2, Fus жана SFPQ, Western blotting менен тастыкталган (сүрөт. 4f).Жакында эле, BRD4 кыска изоформасы суюктук-суюк фаза бөлүү (LLPS) касиеттери бар ядролорду түзөрү кабарланган.РНКны бириктирүүчү протеиндер Fus жана SFPQ ар кандай клеткалык процесстердин LLPSине ортомчулук кылышат жана бул жерде катталбаган BRD4 байланыштыруучу белоктор катары аныкталган.BRD4 жана SFPQ ортосундагы өз ара аракеттешүү кошумча иммунопреципитация (ко-IP) эксперименттери (Figure 4g) менен тастыкталды, бул BRD4 ортомчулугу менен суюктук-суюк фазаны бөлүү үчүн дагы бир механизмди кошумча изилдөөгө татыктуу.Чогуу алганда, бул натыйжалар PDPL белгилүү BRD4 өз ара аракеттенген, ошондой эле белгисиз милдеттүү белокторду аныктоо үчүн идеалдуу платформа экенин көрсөтүп турат.
miniSOG ортомчулугу менен BRD4 жакындык белгилөөнүн схемалык өкүлчүлүгү, экспозиция убакыттары: 2, 5, 10 жана 20 мүн.б Ар кандай жарыктандыруу убакыттарында аныкталган белоктордун кабатталышы.HEK293T-miniSOG-BRD4 аныкталган белок байытуу жапайы түрү HEK293T салыштырмалуу статистикалык маанилүү болгон.с Белгисиз өкүл белгилүү BRD4-байланыштуу белокторду сандык аныктоодо иондун интенсивдүүлүгү көрсөтүлгөн экспозиция убактысынын ичинде.n = 3 биологиялык көз карандысыз үлгүлөр.Маалыматтар орточо ± стандарттык четтөө катары берилген.г 2 мүнөттүк топто аныкталган белоктордун ген онтологиялык анализи (GO).Биринчи он GO шарттары келтирилген.Көбүкчөлөр GO термининин категориясына ылайык түстүү, ал эми көбүктүн өлчөмү ар бир мөөнөттө табылган белоктордун санына пропорционалдуу.BRD4 менен өз ара аракеттенген белоктордун саптык анализи.Сары чөйрөлөр түз клей, боз чөйрөлөр кыйыр клейдин биринчи катмары болуп саналат.Кызыл сызыктар эксперименталдык түрдө аныкталган өз ара аракеттенүүнү, ал эми көк сызыктар болжолдонгон өз ара аракеттенүүнү билдирет.е LC-MS/MS аныкталган өкүл BRD4 милдеттүү максаттары Western blotting тарабынан текшерилген.g Co-иммунопреципитациялык эксперименттер SFPQ жана BRD4 ортосундагы өз ара аракеттенүүнү ырастайт.Бул эксперименттер окшош натыйжалар менен өз алдынча жок дегенде эки жолу кайталанган.Чийки маалыматтар чийки маалымат файлдары түрүндө берилет.
Катталбаган POI менен байланышкан максаттарды аныктоодон тышкары, биз PDPL катталбаган субстраттарга түшүндүрмө берүү үчүн чоң комплекстерде кыйыр байланыштыруучу протеиндердин мүнөздөмөсүн талап кылган ферменттер үчүн субстраттарды аныктоо үчүн ылайыктуу болот деп болжолдойбуз.Паркин (PARK2 тарабынан коддолгон) E3 лигазасы жана паркиндеги мутациялар аутосомдук рецессивдүү жашы жете элек Паркинсон оорусун (AR-JP)42 пайда кылышы белгилүү.Мындан тышкары, паркин митофагия (митохондриялык аутофагия) жана реактивдүү кычкылтек түрлөрүн жок кылуу үчүн маанилүү катары сүрөттөлгөн.Бирок, бир нече паркин субстраттары аныкталганы менен, бул ооруда паркиндин ролу белгисиз бойдон калууда.Анын мүнөздөлбөгөн субстраттарына түшүндүрмө берүү үчүн, PDPL паркиндин N- же C-терминусуна miniSOG кошуу менен сыналган.Клеткалар PINK1-Parkin жолу аркылуу паркинди активдештирүү үчүн карбонил-цианид протон ташуучу м-хлорфенилгидразон (CCCP) менен иштетилди.Биздин BRD4 PDPL натыйжалары менен салыштырганда, паркин N-терминалдык синтези максаттуу протеиндердин көбүрөөк топтомун ачты, бирок ал C-терминустын көбүрөөк бөлүгүн камтыды (210дон 177) (Figure 5a,b жана Кошумча маалыматтар 4).натыйжа N-терминал тегдери Parkin44ти аберрантты түрдө активдештире алат деген кабарларга дал келет.Таң калыштуусу, биздин маалыматтарда Parkin43 үчүн жарыяланган AP-MS натыйжалары менен 18 гана бири-бирине дал келген протеиндер бар болчу, сыягы, клетка линиялары менен протеомика процесстеринин ортосундагы айырмачылыктарга байланыштуу.Төрт белгилүү белоктордон тышкары (ARDM1, HSPA8, PSMD14 жана PSMC3) эки ыкма менен аныкталган (сүрөт 5c)43.LC-MS / MS натыйжаларын андан ары тастыктоо үчүн, PDPL дарылоо жана андан кийинки Western blotting HEK293T ата-энелик клетка анализинин натыйжаларын жана туруктуу N-терминал паркин линиясын салыштыруу үчүн колдонулган.Буга чейин белгисиз максаттар CDK2, DUT, CTBP1 жана PSMC4 белгилүү байланыштыргыч DNAJB1 менен сыналган (сүрөт 5d).
HEK293T клеткаларындагы паркин менен өз ара аракеттенген протеиндердин вулкан сюжети паркиндин N же C-терминусуна бириктирилген туруктуу miniSOG менен (n = 3 көз карандысыз биологиялык эксперимент).Эки куйруктуу Студенттин t-сынагы жанар тоо участокторунда колдонулган.HEK293T терс башкаруу катары колдонулган. Олуттуу өзгөргөн белоктор кызыл түс менен белгиленет (p <0,05 жана >2 эселенген иондун интенсивдүүлүгүнүн айырмасы). Олуттуу өзгөргөн белоктор кызыл түс менен белгиленет (p <0,05 жана >2 эселенген иондун интенсивдүүлүгүнүн айырмасы). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 жана >2-кратная разница в интенсивности ионов). Олуттуу өзгөртүлгөн белоктор кызыл түс менен белгиленет (п <0,05 жана иондун интенсивдүүлүгүндөгү >2 эсе айырма).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Олуттуу өзгөргөн белоктор кызыл түс менен белгиленет (п <0,05 жана > иондук күчтүн 2 эсе айырмасы).HEK293T-miniSOG үчүн маанилүү, бирок HEK293T үчүн маанилүү эмес протеиндер жашыл түстө көрсөтүлгөн.b Венн диаграммасы N-терминал жана C-терминал конструкцияларынын ортосундагы кабатталган протеиндерди көрсөткөн.N-терминал тегдери аберрантты түрдө паркинди активдештирип, көбүрөөк таанымал протеиндерди пайда кылышы мүмкүн.c Венн диаграммасы PDPL жана AP-MS ортосунда бири-бирине дал келген протеиндерди көрсөткөн.Белгилүү интеракторлор тизмеленген, анын ичинде бири-бирин кайталаган 18 протеиндин 4ү жана PDPLде атайын аныкталган 159 протеиндин 11и.г LC-MS/MS тарабынан аныкталган өкүл максаттары Western blotting тарабынан текшерилген.e Ssu72 жана SNW1 катталбаган паркин субстраттары катары аныкталган.Бул FLAG-белгиленген белок плазмидалары HEK293T жана HEK293T-Parkin-miniSOGге трансфекцияланган, андан кийин ар кандай убакыт чекиттеринде CCCP менен дарылоо жүргүзүлгөн.Деградация Паркиндин ашыкча экспрессия линиясында көбүрөөк байкалган.f MG132 протеасомунун ингибиторун колдонуу менен, Ssu72 жана SNW1 деградация процесси протеасома-убиквитинация аркылуу ишке ашырылаары тастыкталды.Бул эксперименттер окшош натыйжалар менен өз алдынча жок дегенде эки жолу кайталанган.Чийки маалыматтар чийки маалымат файлдары түрүндө берилет.
Белгилей кетсек, PDPL тарабынан аныкталган белоктор паркин-байланыштуу белокторду жана алардын субстраттарын камтышы керек.Катталбаган паркин субстраттарын аныктоо үчүн, биз жети аныкталган протеинди (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 жана SNW1) жана трансфекцияланган плазмиддерди тандап алдык, бул гендерди нормалдуу HEK293Tге ачыкка чыгардык жана miniSOG-Parkin's HEK293CP менен дарылоону туруктуу экспрессиялоо.Ssu72 жана SNW1 белокторунун деңгээли туруктуу miniSOG-Parkin линиясында бир топ кыскарган (сүрөт 5e).12 саат бою CCCP менен дарылоо эки субстраттын эң олуттуу бузулушуна алып келди.Ssu72 жана SNW1 деградациясы протеасома-убиквитинация менен жөнгө салынарын иликтөө үчүн, протеасоманын ингибитору MG132 протеасоманын активдүүлүгүн токтотуу үчүн кошулду жана чындыгында биз алардын бузулуу процесси тоскоол болгонун таптык (сүрөт 5f).Кошумча субстраттык эмес максаттар Паркин интеракторлору катары Батыш блоттингди колдонуу менен тастыкталды (Кошумча 10-сүрөт), бул LC-MS/MS менен ырааттуу натыйжаларды көрсөттү.Жыйынтыктап айтканда, PDPL жумушчу агымынын максаттуу протеин трансфекциясын текшерүү менен интеграциясы катталбаган E3 ligase субстраттарын аныктоого мүмкүндүк берет.
Биз мейкиндикте жана убакытта өз ара аракеттенүүчү POIлерди аныктоого мүмкүндүк берген жалпы жакындыкты белгилөө платформасын иштеп чыктык.Платформа miniSOG фотосенсибилизатор протеинине негизделген, анын көлөмү болгону 12 кДа, жетилген APEX2 ферментинин (27 кДа) жарымынан азыраак жана TurboIDдин үчтөн бир бөлүгү (35 кДа).Кичинекей өлчөмдөгү кичинекей белок интерактомдорун изилдөө үчүн колдонуунун спектрин кыйла кеңейтүү керек.Кошумча фотосенсибилизаторлорду, мейли, генетикалык жактан коддолгон белокторбу же кичинекей молекулаларбы, андан ары изилдөө синглет кычкылтекинин кванттык түшүмүн жогорулатуу жана бул ыкманын сезгичтигин кеңейтүү үчүн зарыл.miniSOGтин учурдагы версиясы үчүн жакындык маркерлерин активдештирүү үчүн көк жарыктандыруунун жардамы менен жогорку убактылуу резолюцияга жетишүүгө болот.Мындан тышкары, экспозициянын узактыгы синглет кычкылтекинин чоңураак “булуттарын” чыгарды, натыйжада дисталдык гистидин калдыктарынын модификациясы, белгилөө радиусу көбөйдү жана PDPL мейкиндик резолюциясын тактоо мүмкүнчүлүгү пайда болду.Биз ошондой эле сигнал-фон катышын жогорулатуу үчүн жети химиялык зондду сынап көрдүк жана бул ыкманын артында молекулярдык механизмди изилдедик.Калыс ачык издөө менен айкалышкан TOP-ABPP жумушчу процесси модификациялар гистидиндерде гана болгонун жана гистидиндин көбөйүшү үчүн ырааттуу микрочөйрө байкалбаганын тастыктады, цикл аймагында гистидиндерге орточо артыкчылыктан тышкары.
PDPL ошондой эле протеомдун өзгөчөлүгү жана камтуусу менен, жок эле дегенде, башка жакындык белгилөө жана органеллдерге тиешелүү химиялык изилдөө ыкмалары менен салыштырууга болот.Жакындык маркерлер, ошондой эле ийгиликтүү беттик, лизосома жана секретом менен байланышкан протеомаларды46,47 мүнөздөө үчүн колдонулган.Биз PDPL бул субклеткалык органеллдер менен шайкеш келет деп ишенебиз.Мындан тышкары, биз динамикалык касиеттери жана көбүрөөк убактылуу өз ара аракеттенүүсүнө байланыштуу мембрана менен байланышкан протеиндерге караганда татаалыраак болгон цитозолдук протеин менен байланышуу максаттарын аныктоо менен PDPLге каршы чыктык.PDPL эки протеинге, транскрипциялык коактиватор BRD4 жана оору менен байланышкан лигаза E3 Паркинге колдонулган.Бул эки белок фундаменталдуу биологиялык функциялары үчүн гана эмес, ошондой эле клиникалык актуалдуулугу жана терапиялык потенциалы үчүн тандалган.Бул эки POI үчүн белгилүү милдеттүү өнөктөштөр, ошондой эле катталбаган максаттар аныкталган.Белгилей кетсек, фазалык бөлүнүү менен байланышкан SFPQ протеин ко-IP тарабынан тастыкталган, бул BRD4 (кыска изоформа) LLPSти жөнгө салган жаңы механизмди көрсөтөт.Ошол эле учурда, биз Паркин субстраттарын идентификациялоо кыйыр чаптамаларды идентификациялоону талап кылган сценарий деп эсептейбиз.Биз эки белгисиз паркин субстраттарын аныктап, алардын ubiquitination-proteasome жолу боюнча бузулушун тастыктадык.Жакында гидролаза субстраттарын ферменттер менен кармоо аркылуу аныктоо үчүн механизмге негизделген кармоо стратегиясы иштелип чыкты.Бул абдан күчтүү ыкма болсо да, ал ири комплекстердин пайда болушуна катышкан субстраттарды анализдөө үчүн ылайыктуу эмес жана фермент менен субстраттын ортосунда коваленттик байланыштарды түзүүнү талап кылат.Биз PDPL башка белок комплекстерин жана фермент үй-бүлөлөрүн, мисалы, деубикитиназа жана металлопротеаза үй-бүлөлөрүн изилдөө үчүн кеңейтилиши мүмкүн деп күтөбүз.
SOPP3 деп аталган miniSOGтин жаңы түрү жакшыртылган синглет кычкылтек өндүрүшү менен иштелип чыккан.Биз miniSOGди SOPP3 менен салыштырып, белгилөөнүн жакшырганын таптык, бирок сигналдын ызы-чуу катышы өзгөрүүсүз калган (Кошумча 11-сүрөт).Биз SOPP3 оптималдаштыруу (мисалы, багытталган эволюция аркылуу) кыска жарык убактысын талап кылган эффективдүү фотосенсибилизатор протеиндерге алып келет жана ошону менен көбүрөөк динамикалык клеткалык процесстерди басып алууга мүмкүндүк берет деп божомолдодук.Белгилей кетсек, PDPLдин учурдагы версиясы уюлдук чөйрө менен чектелген, анткени ал көк жарыкты талап кылат жана терең кыртыштарга кире албайт.Бул өзгөчөлүк аны жаныбарлардын моделдерин изилдөөдө колдонууга жол бербейт.Бирок, PDPL менен optogenetics айкалышы, өзгөчө мээде, жаныбарларды изилдөө үчүн мүмкүнчүлүк бере алат.Мындан тышкары, башка инженердик инфракызыл фотосенсибилизаторлор да бул чектөөнү алып салышат.Учурда бул жаатта изилдөө иштери жүрүп жатат.
HEK293T клетка линиясы ATCC (CRL-3216) алынган.Клетка линиясы микоплазма инфекциясына терс сыналган жана 10% түйүлдүктүн сывороткасы (FBS, Vistech, #SE100-B) жана 1% пенициллин/стрептомицин (Hyclone, #SV3001) менен толукталган DMEM (Thermo, #C11995500BT) менен өстүрүлгөн.жылы өскөн.
3-Аминофенилен (3-үлгү) жана (4-этинилфенил)метанамин (4-үлгү) Bidepharmдан сатылып алынган.Пропиламин (зонд 2) Energy-chemicals компаниясынан сатылып алынган.N-(2-Аминофенил)пент-4-намид (зонд 1) жарыяланган методдорго ылайык синтезделген.
Кошумча таблица 1 бул изилдөөдө колдонулган генетикалык конструкциялардын тизмеси.miniSOG жана KillerRed ырааттуулугу P. Zou (Пекин университети) тарабынан берилген белек плазмидасынан клондолгон.Митохондриялык матрицанын максаттуу ырааттуулугу COX4тин 23 N-терминалдык аминокислоталарынан алынган жана Гибсон жыйындысы (Beyotime, #D7010S) аркылуу көрсөтүлгөн векторлорго клондолгон.Эндоплазмалык ретикулумдун мембранасын жана ядросун бутага алуу үчүн SEC61B адам ДНКсы (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) HEK293T клеткаларынын cDNA китепканасынан ПТР менен күчөтүлгөн жана H2B ДНКсы (Д. Лин, Шенжен Бей лабораториясы тарабынан берилген) жана клондоштуруу, жогоруда айтылгандай.Эгерде башкасы көрсөтүлбөсө, трансфекция жана туруктуу клетка линияларын куруу үчүн колдонулган башка белок гендери HEK293T клеткасынын cDNA китепканасынан ПТР күчөтүлгөн.G3S (GGGS) жана G4S (GGGGS) жем протеин менен miniSOG ортосундагы байланыштыруучу катары колдонулган.Бул синтез конструкцияларына V5 эпитоп теги (GKPIPNPLLGLDST) кошулду.Сүт эмүүчүлөрдөгү экспрессия жана туруктуу клетка линиясын түзүү үчүн miniSOG синтез конструкциясы pLX304 lentiviral векторуна субклондолгон.Бактериялык экспрессия үчүн miniSOG C-терминуста 6xHis деп белгиленген pET21a векторуна клондолгон.
HEK293T клеткалары 2,0 х 105 клеткаларга алты уячалуу плиталарга себилген жана 24 сааттан кийин рекомбинантты лентивируалдык плазмиддер (2,4 мкг pLX304) жана вирустук таңгактоочу плазмидалар (1,5 мкг psPAX2 жана 1,2 мкг pMD08yo менен (LipoBee.G02) менен трансфекцияланган. , #C0533), болжол менен 80% биригүү.Түнкү трансфекциядан кийин чөйрө алмаштырылып, дагы 24 саатка инкубацияланды.Вирусту чогултуу 24, 48 жана 72 сааттан кийин жүргүзүлгөн.Максаттуу клетка линияларын жуктурганга чейин вирустук чөйрө 0,8 мкм фильтрден (Merck, #millex-GP) чыпкаланган жана полибрен (Solarbio, #H8761) 8 мкг/мл концентрацияга кошулган.24 сааттан кийин клеткалар чөйрөнү алмаштыруу менен калыбына келтирилди.Клеткалар 5 мкг/мл бластицидинди (Solarbio, # 3513-03-9) төмөнкү катуу тандоо катары алгачкы үч үзүндү үчүн тандалып алынган.Андан кийин 20 мкг / мл кийинки үч үзүндү үчүн бир кыйла катаал режим катары колдонулат.
Клеткалар 12 скважиналуу камераларга (Ibidi, №81201) ар бир скважинага болжол менен 20 000 клетканын тыгыздыгында себилген.HEK293T клеткаларынын адгезиясын жакшыртуу үчүн 50 мкг/мл фибронектинди (Корнинг, #356008) 37°Cде фосфаттык буфердик тузда (PBS, Sangon, #B640435) суюлтуңуз.Камералар 1 саат бою алдын ала иштетилип, андан кийин PBS менен алынып салынды.24 сааттан кийин, клеткалар PBS менен бир жолу жууп, 1 мМ зонд 3 менен жаңы Хэнкстин тең салмактуу туз эритмесинде (HBSS, Gibco, #14025092) 37°Cде 1 саатка инкубацияланды, андан кийин көк LED (460 нм) менен инкубацияланды. ).) бөлмө температурасында 10 мүнөт нурланды.Андан кийин, клеткалар эки жолу PBS менен жууп, бөлмө температурасында 15 мүнөт PBS (Sangon, # E672002) ичинде 4% формальдегид менен бекитилди.Ашыкча формальдегид PBS менен үч жолу жууп, бекитилген клеткалардан чыгарылды.Андан кийин клеткалар PBS ичинде 0,5% Triton X-100 (Сангон, # A600198) менен пермебилизацияланган жана PBS менен 3 жолу жуушкан.Андан кийин камераны алып салыңыз жана ар бир үлгүгө 50 μM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) камтыган 25 мкл чыкылдатуу реакциясынын аралашмасын кошуңуз. жана 0,5 мг/мл натрий аскорбаты (Аладдин, № S105024) жана бөлмө температурасында 30 мүнөт инкубацияланган.Катуу реакциядан кийин клеткалар 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) камтыган PBS менен алты жолу жууп, андан кийин бөлмө температурасында 30 мүнөт PBSTде 5% BSA (Abcone, #B24726) менен бөгөттөлдү.
Коллокализациянын иммуносунациясы үчүн клеткалар көрсөтүлгөн шарттарга ылайык баштапкы антителолор менен инкубацияланган: чычкан анти-V5 теги mAb (1:500, CST, #80076), коёнго анти-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), коёндун поликлоналдык калнексинге каршы антителосу (1:500, Abcam, #ab22595) же коёндун антиламин A/C моноклоналдык антителосу (1:500; CST, #2032) түнү 4 °C.PBST менен 3 жолу жуугандан кийин клеткалар экинчилик антителолор менен инкубацияланган: эчкиге каршы коён Alexa Fluor 488 (Термо, # A11034) 1:1000 суюлтулган, эчки чычканга каршы Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 1:10000 суюлтулган.суюлтуу Бөлмө температурасында 30 мүнөт эритүү.Андан кийин клеткалар PBST менен 3 жолу жууп, бөлмө температурасында 10 мүнөткө PBS ичинде DAPI (Термо, # D1306) менен тескери боёшту.PBS менен 3 жолу жуугандан кийин, клеткалар 50% глицеринге (Sangon, #A600232) PBS менен сүрөткө тартуу үчүн жабылган.Иммунофлуоресценттик сүрөттөр ZEISS LSM 900 Airyscan2 конфокалдык микроскоптун жана ZNE 3.5 программасынын жардамы менен алынган.
Синглет кычкылтектүү флуоресценттүү сүрөттөө үчүн, клеткалар Hanks HEPES буферине 100 нМ Si-DMA кошуудан мурун эки жолу Hanks HEPES буфери менен жуулчу (DOJINDO, #MT05).Жарыктын таасири астында клеткалар 45 мүнөткө 37°C температурада СО2 инкубаторунда инкубацияланган.Андан кийин клеткалар Хэнкстин HEPES буфери менен эки жолу жуулду жана бөлмө температурасында 10 мүнөт бою Хэнкстин HEPES буферинде Hoechst менен карама-каршы боёлуп, ZEISS LSM 900 конфокалдык микроскоптун жардамы менен визуализацияланды., #M36008) кальций жана магний камтыган HBSS буферинде.Жарыктын же доксорубициндин (MCE, #HY-15142A) таасиринен кийин, клеткалар 37°C СО2 инкубаторунда 10 мүнөткө инкубацияланган, HBSS буфери менен эки жолу жууп, бөлмө температурасында HBSS буферинде Hoechst менен инкубацияланган.мүнөт.Доксорубицин 30 мүнөт бою 1% BSA камтыган HBSS ичинде 20 мкм доксорубицин менен иштетилген оң изилдөөчү контрол катары колдонулган.Immunofluorescent сүрөттөр Zeiss LSM 900 конфокалдык микроскоптун жардамы менен алынган.
Мито-miniSOG туруктуу экспрессия HEK293T клеткалары 15 см идиштерге болжол менен 30% тыгыздыкта себилген.48 сааттан кийин, ~80% кошулган жерге жеткенде, клеткалар PBS менен бир жолу жууп, жаңы HBSS буферинде 1 mM Probe 3 менен 37°C температурада 1 саатка инкубацияланды жана андан кийин бөлмөдө 10 мүнөткө көк LED менен жарыктандырылды. температура..Андан кийин, клеткалар эки жолу PBS менен жуулду, кырылды жана EDTA-эркин протеаза ингибиторлорун (MCE, #HY-K0011) камтыган муздай муздак PBS буферинде кайра суспензияланды.Клеткалар учу 1 мүнөткө (35% амплитудада 1 секунд күйгүзүлгөн жана 1 секунд өчүрүлгөн) sonicating аркылуу лизистелген.Алынган аралашма таштандыларды алып салуу үчүн 15,871 xg центрифугасында 4°Cде 10 мүнөттө центрифугаланган жана супернатанттын концентрациясы BCA протеинди анализдөө комплекти (Beyotime, # P0009) менен 4 мг/млге туураланган.0,1 мм photodegradable биотин азид (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, # A600974), 0,1 mM TBTA лиганд (Aladdin, # T162437) жана SO4 in CuM 1 m bottomcuM менен жогорудагы lysate 1 мл бириктирүү бөлмө температурасында 1 саатка чейин айлануу.Катуу реакциядан кийин аралашманы 10 мл айнек флакондогу алдын ала аралаштырган эритмеге (MeOH:CHCl3:H2O = 4 мл:1 мл:3 мл) кошобуз.Үлгүлөр аралаштырылган жана бөлмө температурасында 10 мүнөт 4500 г центрифугаланган.Төмөнкү жана үстүнкү эритмелер ташталды, чөкмө эки жолу 1 мл метанол менен жуулду жана 15871 × г центрифугада 5 мүнөт 4°С.25 мМ аммоний бикарбонатына (ABC, Aladdin, н. A110539) 1 мл 8 М карбамид (Аладдин, н. U111902) чөкмөсүн эритүү үчүн кошуңуз.Үлгүлөр 10 мм дитиотреитол (Sangon, #A100281 25 мм ABC) менен 55°Cде 40 мүнөткө калыбына келтирилди, андан кийин караңгыда бөлмө температурасында 15 мМ жаңы йодоацетамид (Sangon, #A600539) кошулду.30 мүнөттүн ичинде алкилдөө..Реакцияны токтотуу үчүн кошумча 5 мм дитиотрейтол кошулган.1 мл PBS менен 3 жолу жууп, ар бир үлгү үчүн болжол менен 100 мкл NeutrAvidin агароз мончокторун (Термо, #29202) даярдаңыз.Жогорудагы протеомдун эритмеси 5 мл PBS менен суюлтулган жана бөлмө температурасында 4 саат бою алдын ала жуулган NeutrAvidin агароздук мончоктору менен инкубацияланган.Мончоктор андан кийин 0,2% SDS (Sangon, #A600485) камтыган 5 мл PBS менен 3 жолу, 1М карбамид камтыган 5 мл PBS менен 3 жолу жана 5 мл ddH2O менен 3 жолу жуулчу.Мончоктор андан кийин центрифугалоо жолу менен жыйналып, 1 М карбамид, 1 мМ CaCl 2 (Macklin, #C805228) жана 20 нг/мкл трипсин (Promega, #V5280) камтыган 200 мкл 25 мм ABCде кайра токтотулду.Айлануу менен 37°C түнү Trypsinize.Реакция рН 2-3 жеткенге чейин кумурска кислотасын (Термо, № A117-50) кошуу менен токтотулду.Мончоктор 0,2% СДС камтыган 1 мл PBS менен 3 жолу, 1 М карбамид камтыган 1 мл PBS менен 3 жолу, андан кийин 1 мл дистилденген суу менен 3 жолу жуулган.Өзгөртүлгөн пептиддер 200 мкл 70% MeOH колдонуу менен 90 мүнөткө жарык лизис (365 нм) менен чыгарылган.Центрифугадан кийин супернатант чогултулду.Мончоктор андан кийин 100 мкл 70% MeOH менен бир жолу жууп, супернатанттар топтолду.Үлгүлөр Speedvac вакуумдук концентраторунда кургатылган жана анализге чейин -20°Cде сакталган.
Синглет кычкылтек менен модификацияланган пептиддерди аныктоо жана санын аныктоо үчүн үлгүлөр 0,1% кумурска кислотасында кайра эритилди жана 1 мкг пептиддер Tune нано ESI булагы менен жабдылган Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масс-спектрометринин жардамы менен анализденди жана 4.3 сатуучу программалык камсыздоосунан Xcalibur.Үлгүлөр 3 мкм C18 материалы (ReproSil-pur, #r13.b9.) менен 75 мкм × 15 см ички таңгакталган капиллярдык колонкада бөлүнгөн жана EASY-nLC 1200 UHPLC тутумуна (Термо) туташтырылган.Пептиддер сызыктуу 95 мүнөттүк градиент хроматографиясы аркылуу 8% эриткичтен В 50% эриткичке чейин бөлүнгөн (А = 0,1% суудагы кумурска кислотасы, В = 80% ацетонитрилде 0,1% кумурска кислотасы), андан кийин сызыктуу түрдө 98% B минге чейин көбөйтүлгөн. 6 мин ичинде 300 нл/мин агымынын ылдамдыгы.Orbitrap Fusion Lumos берилиштерге жараша толук MS сканерлөө жана MS2 скандоо ортосунда кезектешип маалыматтарды чогултат.Чачыратуу чыңалуусу 2,1 кВ жана ион ташуучу капиллярдын температурасы 320°С болгон.MS спектрлери (350-2000 м/ц) 120 000, AGC 4 × 105 жана 150 мс максималдуу киргизүү убактысы менен чогултулган.Ар бир толук сканерлөөдө 10 эң кеңири тараган көбөйтүлгөн заряддуу прекурсорлор HCD аркылуу 30% нормалдаштырылган кагылышуу энергиясы, 1,6 м/з төрт полюс изоляция терезеси жана 30 000 резолюция орнотуусу менен фрагменттелди.5×104 жана максималдуу киргизүү убактысы 150 мс менен тандемдик масс-спектрометрия үчүн AGC максаттуу.Динамикалык өзгөчөлүк 30 секундага коюлган. Белгисиз иондор же заряды 1+ жана >7+ болгондор MS/MS үчүн четке кагылды. Белгисиз иондор же заряды 1+ жана >7+ болгондор MS/MS үчүн четке кагылды. Неназначенные ион же ион с зарядом 1+ жана >7+ менен отклоны үчүн МС/МС. Белгисиз иондор же заряды 1+ жана >7+ иондор MS/MS үчүн четке кагылды.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ менен отклоны для МС/МС. Белгисиз иондор же заряды 1+ жана >7+ болгон иондор MS/MS үчүн четке кагылды.
чийки маалыматтар MSFragger негизинде FragPipe эсептөө платформасын колдонуу менен иштетилет.Массалык кыйшаюулар жана тиешелүү аминокислоталар -150дөн 500 Да чейинки прекурсорлордун масса толеранттуулугу менен ачык издөө алгоритмин колдонуу менен аныкталган.Андан кийин модификацияланган пептиддер Гистидиндин модификациялары аркылуу PDде массасы +229.0964 жана +247.1069 Да болгон (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) аныкталган.
Бириктирилген miniSOG генин туруктуу билдирген клеткалар 6 см идиштерге салынды.~80% кошулгандан кийин, клеткалар HBSS (Gibco, #14025092) менен бир жолу жууп, андан кийин HBSSте химиялык зонддор менен 37°C температурада 1 саат инкубацияланды жана көк жарык менен жарыктандырылды.10W LED бөлмө температурасында 20 мүнөт.Кайсы түрдөгү реактивдүү кычкылтектин PDPLге катышканын аныктоо үчүн 0,5 мм С витамини (MCE, #HY-B0166), 5 мм Тролокс (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , Кошумча катары клеткаларга 100 мм маннитол (Energy Chemical, # 69-65-8), 100 мкм H2O2, 10 мМ NaN3 кошулган.Муздак PBS менен жуугандан кийин, клеткалар кырылып, 1,5 мл центрифугалык түтүктөргө чогултулуп, EDTA жок 1x протеаза ингибитору менен 200 мкл PBS ичинде 1 мүнөт учу менен sonicated (1 с жана 1 с жок, амплитудасы 35%).Натыйжада аралашма 15,871 × г центрифугада 10 мүнөт 4 °C жана супернатанттын концентрациясы BCA протеинди анализдөө комплектинин жардамы менен 1 мг/млге туураланган.Жогорудагы лизаттын болжол менен 50 мкл 0,1 мМ родамин азиди (Аладдин, № T131368), 1 мм TCEP, 0,1 мМ TBTA лиганд жана 1 мм CuSO4 менен 1 саат бою бөлмө температурасында ылдыйдан өйдө айлануу менен инкубацияланган.Чыкылдатуу реакциясынан кийин, үлгүлөргө 250 мкл алдын ала муздатылган ацетон кошуп, -20°C температурада 20 мүнөт инкубациялоо жана 6010×g температурада 10 мүнөт 4°C центрифугалоо жолу менен ацетон менен чөктүрдү.Пеллетти чогултуп, 50 мкл 1x Laemmli буферинде 95 °Cде 10 мүнөт кайнатыңыз.Андан кийин үлгүлөр SDS-PAGE узун гелдеринде анализденип, Image Lab Touch программасы менен Bio-rad ChemiDoc MP Touch сүрөттөө тутумунун жардамы менен визуализацияланган.
Рекомбинантты miniSOG-6xHis протеининин экспрессиясы жана тазаланышы мурда сүрөттөлгөндөй аткарылган.Кыскача айтканда, E. coli BL21(DE3) клеткалары (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis менен өзгөртүлгөн жана белоктун экспрессиясы 0,5 мМ IPTG (Sangon, #A600168) менен индукцияланган.Клетка лизисинен кийин белоктор Ni-NTA агароздук мончокторду (MCE, № 70666) колдонуу менен тазаланып, PBSге каршы диализден өтүп, -80°Cде сакталган.
Антителого негизделген in vitro энбелгисинин жакындыгын анализдөө үчүн 100 мкМ тазаланган miniSOG, 1 мМ зонд 3 жана 1 мкг анти-энбелги чычкан моноклоналдык антителосун (TransGen, #HT501-01) PBS менен 50 мкл жалпы реакциянын көлөмүнө чейин аралаштырыңыз..Реакция аралашмасы бөлмө температурасында 0, 2, 5, 10 жана 20 мүнөткө көк LED жарык менен нурланды.Аралашма 0,1 мМ биотин-PEG3-азид (Аладдин, # B122225), 1 мМ TCEP, 0,1 мМ TBTA лиганд жана 1 мМ CuSO4 менен бөлмө температурасында 1 саат бою өйдө кыймылдаткычта инкубацияланган.Катуу реакциядан кийин 4x Laemmli буферин түздөн-түз аралашмага кошуп, 95°C температурада 10 мүнөт кайнатыңыз.Үлгүлөр SDS-PAGE гелдеринде анализденип, стрептавидин-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) менен вестерн тазалоо менен анализденди.
C-терминалдык амидация (LHDALDAK-CONH2) менен гистидин камтыган синтетикалык пептид жакын жердеги пептиддерге негизделген in vitro этикеткалоону талдоо үчүн колдонулган.Бул анализде 100 мкм тазаланган miniSOG, 10 мМ зонд 3 жана 2 мкг/мл синтетикалык пептид PBSте 50 мкл жалпы реакция көлөмүндө аралаштырылды.Реакция аралашмасы бөлмө температурасында 1 саат бою көк LED жарык менен нурлантылды.Бир микролитр үлгү LC-MS тутумунун (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight масс-спектрометринин MassLynx спектрин талдоо программасы менен) жардамы менен талданды.
MiniSOG синтез генин туруктуу экспрессия кылган HEK293T клеткалары ар кандай органеллдердин локализациясы (Mito, ER, Nucleus) менен линиялар үчүн 10 см идиштерге жана Parkin-miniSOG жана BRD4-miniSOG линиялары үчүн 15 см идиштерге себилген.~90% кошулгандан кийин, клеткалар HBSS менен бир жолу жууп, андан кийин HBSSте 3-зонд менен 37°Cде 1 саат инкубацияланды жана бөлмө температурасында 10 Вт көк LED менен жарыктандырылды.Паркинди контактсыз маркировкалоо үчүн 10 мкМ протон карбонил цианидди алып жүрүүчү m-chlorofenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) HBSSте 3 зонд менен 37°C температурада 1 саатка кошулду.Клетка лизиси, чыкылдатуу химиясы, редукциялоо жана алкилдөө кадамдары жогоруда сүрөттөлгөндөй эле, бирок 2 мг лизат кошулуп, фотодеградациялануучу биотин азидинин ордуна басуу реакциясында биотин PEG3 азиди колдонулган.Байытылгандан кийин мончоктор 0,2% SDS камтыган 5 мл PBS менен 3 жолу, 1 М карбамид камтыган 5 мл PBS менен 3 жолу жана 5 мл PBS менен 3 жолу жуулчу.Андан кийин 2 мкг трипсин 300 мкл 25 мМ ABC камтыган 1 М карбамидге кошулган, протеинди 37°Cде түнү бою бөлгөн.Реакция рН 2-3 болгонго чейин кумурска кислотасын кошуу менен токтотулду.Мончоктордо трипсинациялоодон кийин пептиддик эритме SOLAµ HRP колонкасы (Термо, №60209-001) аркылуу тузсуздандырылган жана Speedvac вакуумдук концентраторунда кургатылган.Пептиддер 0,1% кумурска кислотасында кайра эриди жана 500 нг пептиддер жогоруда сүрөттөлгөн нано-ESI булагы менен жабдылган Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масс-спектрометринин жардамы менен анализденди.Пептиддер коммерциялык RP-HPLC колонналарында (75 мкм х 2 см) (Термо, № 164946) жана аналитикалык RP-HPLC мамычаларында (75 мкм х 25 см) (Термо, № 164941) бөлүнгөн, экөө тең 2 мкм менен толтурулган.градиент 8% дан 35% ACN 60 мүнөт ичинде, андан кийин сызыктуу 300 Nl/мин агымынын ылдамдыгы боюнча 6 мүнөт ичинде 98% B чейин жогорулаган.MS спектрлери (350-1500 м/ц) 60 000, AGC 4 × 105 жана 50 мс максималдуу киргизүү убактысы менен чогултулган.Тандалган иондор HCD менен 3 секунддук циклде ырааттуу түрдө кагылышуу энергиясы 30%, төрт уюлду изоляциялоо терезеси 1,6 м/з жана 15000 резолюциясы менен фрагменттелди. 5 × 104 тандемдик масс-спектрометр AGC бутасы жана максималдуу сайынуу убактысы 22 мс пайдаланылды.Динамикалык алып салуу 45 секундага коюлган. Белгисиз иондор же заряды 1+ жана >7+ болгондор MS/MS үчүн четке кагылды. Белгисиз иондор же заряды 1+ жана >7+ болгондор MS/MS үчүн четке кагылды. Неназначенные ион же ион с зарядом 1+ жана >7+ менен отклоны үчүн МС/МС. Белгисиз иондор же заряды 1+ жана >7+ иондор MS/MS үчүн четке кагылды.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ менен отклоны для МС/МС. Белгисиз иондор же заряды 1+ жана >7+ болгон иондор MS/MS үчүн четке кагылды.
NeutrAvidin мончокторун байытууга чейин үлгү даярдоо кадамдары жогоруда сүрөттөлгөн LC-MS/MS анализиндегидей эле.Болжол менен 50 мкг лизат жүктөөнү көзөмөлдөө үчүн жана 2 мг лизат чыкылдатуу реакциялары үчүн колдонулган.Байытылгандан жана нейтравидин менен жуугандан кийин, агароздук чайыр мончокторуна 50 мкл Лаэммли буферин кошуп, 95°C температурада 5 мүнөт кайнатуу аркылуу байланган белоктор элюцияланган.Контролдук жүктөө киргизүү жана мончок менен байытылган үлгүлөр SDS-PAGE тарабынан анализденип, стандарттык Western Blot ыкмалары менен PVDF мембраналарына (Millipore, #ISEQ00010) өткөрүлүп берилди.Мембраналар 5% майсыздандырылган сүт (Sangon, #A600669) менен 0,1% твен-20 (TBST) камтыган TBS менен тосулуп, биринчилик жана экинчилик антителолор менен удаалаш инкубацияланган.Негизги антителолор ТБСТте 1:1000 5% майсыздандырылган сүттө суюлтулган жана түнү 4°Cде инкубацияланган.Экинчилик антителолор 1:5000 катышында колдонулуп, бөлмө температурасында 1 саат инкубацияланды.мембраналар Chemidoc MP сүрөт системасы аркылуу хемилюминесценция аркылуу визуализацияланган.Сүрөттөгү тактардын жана гелдердин кесилбеген сканерлери чийки маалымат катары берилген.
Бул изилдөөдө колдонулган негизги антителолор: коёнго каршы SFPQ моноклоналдык антитело (CST, № 71992), коёнго каршы FUS моноклондук антитело (CST, № 67840), коёнго каршы NSUN2 поликлоналдык антитело (Proteintech, № 20854-1-) AP), коёнго каршы mSin3A поликлоналдык антитело (Abcam, #ab3479), чычкандын тегине каршы моноклоналдык антитело (TransGen, #HT201-02), чычканга анти-β-актин моноклоналдык антитело (TransGen, #HC201-01), коёнго каршы антитело -CDK2 моноклоналдык антитело (ABclonal, #A0094), CTBP1ге коёндун моноклоналдык антителосу (ABclonal, #A11600), DUTге коендун поликлоналдык антителосу (ABclonal, #A2901), PSMC4ге коёндун поликлоналдык антителосу (ABclonal, #A2901), DNAJB1 поликлоналдык антитело (ABclonal, # A5504).Бул антителолор ТБСТте 5% майсыздандырылган сүттө 1:1000 суюлтууда колдонулган.Бул изилдөөдө колдонулган экинчилик антителолор 1:5000 суюлтуусунда коёнго каршы IgG (TransGen, #HS101-01), чычканга каршы IgG (TransGen, #HS201-01) камтылган.
BRD4 SFPQ менен өз ара аракеттенишээрин андан ары иликтөө үчүн HEK293T ашыкча экспрессиялоочу туруктуу HEK293T жана BRD4-miniSOG клеткалары 10 см идиштерге салынды.Клеткалар муздак PBS менен жууп, 1 мл Пирс IP лизис буферинде (Термо Фишер, # 87787) EDTA-эркин протеаза ингибитору менен 30 мүнөт 4°Cде лизистелген.Андан кийин лизаттар 1,5 мл центрифугалык түтүктөргө чогултулуп, 4°Cде 10 мүнөт 15,871 xg центрифугаланган.Супернатант жыйналды жана 5 мкг анти-V5 белгиси бар чычкан моноклоналдык антителосу (CST, #80076) менен түнү 4°Cде инкубацияланды.Болжол менен 50 мкл протеин A/G магниттик мончокторун (MCE, #HY-K0202) 0,5% Tween-20 камтыган PBS менен эки жолу жуу.Андан кийин клетка лизаттары магниттик мончоктор менен 4 саат бою 4°C теменден өйдө айлануу менен инкубацияланган.Андан кийин мончоктор 1 мл PBST буфери менен төрт жолу жууп, 95°C температурада 5 мүнөт кайнатылды.Үлгүлөр SDS-PAGE гелдеринде анализденип, стандарттык Western Blot ыкмаларын колдонуу менен PVDF мембраналарына өткөрүлүп берилди.Мембраналар TBSTдеги 5% майсыздандырылган сүттө тосулуп, биринчилик жана экинчилик антителолор менен удаалаш инкубацияланган.Негизги антитело коёнунун анти-SFPQ моноклоналдык антителосу (CST, #71992) TBSTте 5% майсыздандырылган сүттө 1:1000 катышында колдонулган жана түнү 4°Cде инкубацияланган.Коёнго каршы IgG 1:5000 пропорциясында колдонулган жана бөлмө температурасында 1 саат инкубацияланган.мембраналар Chemidoc MP сүрөт системасы аркылуу хемилюминесценция аркылуу визуализацияланган.
Эритүүчү жеткиликтүү беттик аймакты (SASA) талдоо үчүн колдонулган бардык структуралар Протеин маалыматтар банкынан (PDB)52 же AlphaFold протеин структурасынын маалымат базасынан53 алынган.Абсолюттук SASA FreeSASA программасын колдонуу менен ар бир калдык үчүн эсептелген.Ар бир структура үчүн орточо SASA алуу үчүн белгиленген гистидин жана анын кошуналары үчүн толук жана ачык-айкын SASA маалыматтары гана колдонулган.Ар бир гистидин үчүн салыштырмалуу эриткичтин жеткиликтүүлүгү (RSA) SASA абсолюттук маанисин эриткич үчүн жеткиликтүү болгон эмпирикалык максималдуу мүмкүн болгон калдык бетинин аянтына бөлүү жолу менен эсептелген.Эгерде орточо RSA 20%дан төмөн болсо, бардык гистидиндер жашыруун деп классификацияланган, антпесе ачыкка чыккан56.
DDA режиминде алынган чийки файлдар Proteome Discoverer (v2.5) же MSfragger (Fragpipe v15.0) аркылуу жалпы булгоочу заттарды камтыган SwissProt текшерилген протеиндер базасында изделген.Пептиддерге толук трипсин керек болгон, эки бөлүнүү жери жок, карбамойл метилдеши белгиленген модификация катары жана метиониндин кычкылдануусу динамикалык модификация катары.Прекурсордун жана фрагменттин салмагынын толеранттуулугу тиешелүүлүгүнө жараша 10 промилле жана 0,02 Да (MS2 Orbitrap) орнотулган. Булгоочу заттар алынып салынды, протеиндер чыпкаланып, <1% жалган ачылыш ченге ээ болду. Булгоочу заттар алынып салынды, протеиндер чыпкаланып, <1% жалган ачылыш ченге ээ болду. Попадания загрязняющих веществ бул удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Булгоочу заттар алынып салынды жана протеиндер фильтрден өткөрүлдү, бул <1% жалган аныктоо чен.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ були удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. Булгоочу заттар алынып салынды жана протеиндер <1% жалган оң көрсөткүчкө жетүү үчүн чыпкаланды.Этикеткаларды колдонбостон сандык талдоо үчүн үч биологиялык кайталоодон алынган нормалдаштырылган белоктун мазмуну колдонулган.Белоктун субклеткалык локализациясынын анализи DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 жана Элис Тинг тобу тарабынан түзүлгөн жана жарыяланган маалымат базаларынан Gene Ontology (GO) анализин колдонуу менен жүргүзүлгөн.Вулкан картасы Персейден алынган (v1.6.15.0). Белоктун көптүгүнүн бүктөлүшүнүн өзгөрүүлөрү эки тараптуу t-тесттин жардамы менен статистикалык мааниге ээ болуу үчүн сыналган жана протеин хиттери молчулуктун өзгөрүшү >2 (башкача айтылбаса) жана p мааниси <0,05 менен аныкталган. Белоктун көптүгүнүн бүктөлүшүнүн өзгөрүүлөрү эки тараптуу t-тесттин жардамы менен статистикалык мааниге ээ болуу үчүн сыналган жана протеин хиттери молчулуктун өзгөрүшү >2 (башкача айтылбаса) жана p мааниси <0,05 менен аныкталган. Изменения кратности содержания белка менен проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, жана совпадения белков жана идентифицированы с изменением содержания> 2 (эсли не указано иное) и значение p <0, p <0,. Протеин мазмуну бүктөлмө өзгөрүүлөр эки куйруктуу t-тест колдонуу менен статистикалык маанилүүлүгү үчүн сыналган, жана белок дал мазмун өзгөртүү >2 (башкача белгиленбесе) жана AP баасы <0,05 менен аныкталган.Л л л л л л л л л л> 2 (除非 蛋白质 有有) 和 p 值 <0.05.Л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л л " Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (эсли не указано иное) жана p-значений <0,05. Протеиндин курамындагы бүктөлмөлөрдүн өзгөрүшүнүн статистикалык мааниси эки куйруктуу t-тесттин жардамы менен сыналды жана протеиндин дал келүүсү мазмундагы өзгөрүүлөр >2 (эгер башкасы көрсөтүлбөсө) жана p-маанилери <0,05 үчүн аныкталды.Протеиндердин өз ара аракеттенүүсүн талдоо String маалымат базасы менен бирге GO анализин колдонуу менен жүргүзүлгөн.
Ушундай эле натыйжалар менен үч биологиялык кайталоо жүргүзүлдү.Статистикалык талдоо GraphPad Prism (GraphPad программалык камсыздоосу) менен жүргүзүлдү жана жанар тоо участоктору Perseus (v1.6.15.0) менен түзүлдү.Эки топту салыштыруу үчүн, p-маанилери эки тараптуу Студенттин t-тестинин жардамы менен аныкталган.Эксперименталдык топто кеминде эки жолу аныкталган синглтондук белоктор гана вулкан участокторуна киргизилген жана контролдук топтогу тиешелүү жетишпеген маанилер нормалдуу бөлүштүрүүдөн Персеус менен алмаштырылган, ошондуктан p-маанисин эсептөөгө болот.Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.Статистикалык талдоо үчүн протеомикалык анализдерде, жок эле дегенде, эки биологиялык кайталоодо пайда болгон белоктордун көптүгү сакталган.Статистикалык ыкмалар тандоо өлчөмүн алдын ала аныктоо үчүн колдонулган эмес.эксперименттер кокустук эмес.Изилдөөчүлөр эксперимент жана натыйжаларды баалоо учурундагы тапшырмаларга көз жумган эмес.
Изилдөө дизайны боюнча көбүрөөк маалымат алуу үчүн, бул макалага шилтемеленген Табиятты изилдөө отчетунун абстракттуулугун караңыз.
Бул изилдөөдө алынган масс-спектрометриялык маалыматтар ProteomeXchange Консорциумуна iProX57 өнөктөш репозиторийси аркылуу ID PXD034811 (PDPL-MS маалымат топтому) маалымат топтому астында тапшырылды.Чийки маалыматтар чийки маалымат файлдары түрүндө берилет.Бул макалада баштапкы маалыматтарды берет.
Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. Коңшулук менен таанышуу: протеиндик комплекстерди жана карта органеллдерин мүнөздөө үчүн жакындыкка көз каранды биотинилдештирүүнү колдонуу. Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. Коңшулук менен таанышуу: протеиндик комплекстерди жана карта органеллдерин мүнөздөө үчүн жакындыкка көз каранды биотинилдештирүүнү колдонуу.Гинграс, AS, Abe, KT жана Raut, B. Айлана-чөйрө менен таанышуу: протеин комплекстерин жана карта органеллдерин мүнөздөш үчүн жакындыгынан көз каранды biotinylation колдонуу. Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并。 Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. Коңшулукту түшүнүү: коңшулуктун биологиялык жашоого болгон көз карандылыгын колдонуңуз.Gngras, AS, Abe, KT жана Raut, B. Түшүнүү жакындыгы: протеин комплекстеринин мүнөздөмөсү жана жакындыкка көз каранды biotinylation колдонуп органеллдердин картасы.Учурдагы.Менин оюм.Химиялык.биология 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Декстер энергиясын иммундук клеткаларга өткөрүп берүү менен микрочөйрөнүн картасын түзүү.Илим 367, 1091–1097 (2020).
Гертлинг, ЭЛ жана башкалар.Эки протеомдук масштабдуу тармактар ​​адамдын интерактомунун клеткага мүнөздүү ремоделизациясын аныктайт.184, 3022–3040.e3028 клеткалары (2021).