Жаңылыктар

Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы чектелген CSS колдоосуна ээ.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Ал ортодо, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Рак клеткалары уюлдук стрессти жеңүү үчүн ар кандай механизмдерди иштеп чыгышты жана өнүгүүнү улантышты.Протеинкиназа R (PKR) жана анын протеин активатору (PACT) клетканын көбөйүшүнө жана апоптозго бөгөт коюуга алып келген ар кандай стресс сигналдарын көзөмөлдөгөн алгачкы жооп берүүчү болуп саналат.Бирок, рак клеткаларында PACT-PKR жолунун жөнгө салуу негизинен белгисиз бойдон калууда.Бул жерде биз узак эмес коддоочу РНК (lncRNA) aspartyl tRNA синтетаза антисенс РНК 1 (DARS-AS1) түздөн-түз PACT-PKR жолунун бөгөт коюу менен алектенет жана рак клеткаларынын көбөйүшүнө өбөлгө түзөт деп таптык.CRISPRi 971 рак менен байланышкан lncRNAнын масштабдуу функционалдык скринингин колдонуу менен, биз DARS-AS1 рак клеткаларынын көбөйүшүнө байланыштуу экенин таптык.Ошондуктан, DARS-AS1 нокаут клетканын көбөйүшүнө тоскоол болот жана in vitro ар кандай рак клеткаларынын линияларында рак клеткасынын апоптозуна өбөлгө түзөт жана in vivo шишиктин өсүшүн кыйла азайтат.Механикалык түрдө, DARS-AS1 PACT активдештирүү доменине түздөн-түз байланышат жана PACT-PKR өз ара аракеттенүүсүн алдын алат, ошону менен PKR активдешүүсүн, eIF2α фосфорлануусун азайтат жана апоптотикалык клетканын өлүмүнө бөгөт коёт.Клиникалык жактан DARS-AS1 көп рак ооруларында кеңири чагылдырылат жана бул lncRNAнын ашыкча экспрессиясы начар прогноздун көрсөткүчү болуп саналат.Бул изилдөө DARS-AS1 lncRNA тарабынан PACT-PKR жолунун рактын спецификалык жөнгө салынышын түшүндүрөт жана ракты болжолдоо жана дарылоо үчүн дагы бир максатты камсыз кылат.
Стресске көнүү жөндөмдүүлүгү рак клеткаларынын жашоосунун жана көбөйүшүнүн маанилүү өзгөчөлүгү болуп саналат.Рак оорусунун тез таралышы жана метаболикалык белгилери катаал микрочөйрөдө - аш болумдуу заттардын жетишсиздигинде, гипоксияда жана төмөн рНда - клетканын өлүмүнүн сигналдык жолдорун козгой алат.Р535, жылуулук шок белоктору 6, 7, KRAS8, 9 жана HIF-110, 11, 12, 13 сыяктуу стресске сезгич гендердин дисрегуляциясы ракта көп байкалат, ошону менен апоптозду бөгөттөп, жашоого көмөктөшөт.
Протеинкиназа R (PKR) маанилүү стресс сенсору жана эукариоттук демилге факторунун 2α (eIF2α) суббирдик киназасы, клетканын өлүмү менен клеткалык стрессти байланыштырган котормо жөнгө салуучу.PKR адегенде чет элдик кош тилкелүү РНКны (dsRNA) аныктоо менен вируска каршы протеин катары аныкталган.активдештирүү боюнча, PKR phosphorylates eIF2α вирустук жана клеткалык протеин синтезин 14,15,16 бөгөт коюу.PACT (PKR активатор протеин) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 жок болгон биринчи PKR активатор протеин катары аныкталган.PKR менен түздөн-түз өз ара аракеттенүү аркылуу PACT ар кандай стресстерди (сывороткадагы ачарчылык, пероксид же арсенит менен дарылоо) PKRге жана ылдый агымдагы сигнал жолдоруна өткөрөт.eIF2α phosphorylation тышкары, PACT ортомчу PKR жандандыруу PI3K / Akt24 жолу аркылуу өзгөртүлгөн редокс статусун, p5325,26 жана NF-κB27,28 аркылуу күчөтүлгөн текшерүү, анын ичинде стресс жооп менен байланышкан ар кандай окуяларды козгойт Транскрипцияны жөнгө салат, 29. Стресске жооп кайтарууда, пролиферацияда, апоптоздо жана башка негизги клеткалык процесстерде алардын маанилүү ролун эске алуу менен, PKR жана PACT көптөгөн оорулар, айрыкча рак30,31,32,33 үчүн келечектүү дарылоо максаттары болуп саналат.Бирок, бул pleiotropic функционалдык жана биологиялык маанилүүлүгүнө карабастан, рак клеткаларында PACT/PKR активдүүлүгүн жөнгө салуу кыйын бойдон калууда.
lncRNAs - белок коддоо потенциалы жок 200 нуклеотидден чоңураак транскрипттер.Бүтүндөй геномду секвенирлөөнүн алдыңкы долбоорлору миңдеген lncRNAларды аныктагандан бери,35,36 алардын биологиялык функцияларын түшүндүрүү үчүн көп күч-аракет жумшалды.Өсүп жаткан изилдөөлөр lncRNAs көптөгөн биологиялык процесстерге37 катышарын, анын ичинде Х-хромосоманын инактивациясын38,39, импринтинг40, транскрипция41,42, которуу43 жана ал тургай рактын өсүшү44,45,46,47 да катышарын көрсөттү.Бул изилдөөлөр көптөгөн lncRNAs PACT/PKR жолунда тартылган деп билдирди.Мындай изилдөөлөрдүн бири lncRNA ASPACT PACT транскрипциясына тоскоол болгонун жана PACT mRNAсынын ядролук кармалышын жогорулатканын көрсөттү.Башка изилдөөлөр көрсөткөндөй, lncRNA nc886 PKR менен байланышат жана анын phosphorylation49,50 тоскоол болот.Буга чейин, PACT ортомчулугу менен PKR активдештирүүнү жөнгө салуучу lncRNA билдириле элек.
Aspartyl-tRNA синтетаза антисенс РНК 1 (DARS-AS1) онкогендик lncRNA51,52,53,54 катары аныкталган.miP-194-5p53, miP-12952 жана miP-532-3p51 жөнгө салуу аркылуу DARS-AS1 тиешелүүлүгүнө жараша ачык клеткалуу бөйрөк клеткасынын карциномасынын, калкан безинин карциномасынын жана майда эмес клеткалуу өпкөнүн карциномасынын өсүшүнө көмөктөшөт.Тонг жана кесиптештери ошондой эле DARS-AS1 протеин 39 (RBM39) РНК-милдеттүү мотивинин туруктуулугун сактоо менен миелома прогрессия өбөлгө түзөт деп табылган.Бирок, бул lncRNA PACT-PKR активдештирүүнү жана рак клеткаларынын стресстик реакциясын жөнгө салууга катышы бар же жокпу, эч кандай изилдөөлөр жүргүзүлгөн эмес.
Бул жерде биз CRISPRi тутумун колдонуу менен масштабдуу функцияны жоготкон экранды жасадык жана DARS-AS1 lncRNA рак клеткаларынын бир нече түрлөрүнүн көбөйүшүнө өбөлгө түзөрүн аныктадык.Мындан тышкары, биз негизги механизмди аныктадык: DARS-AS1 түздөн-түз PACT менен байланышат, PACT жана PKR менен байланышты токтотот, төмөнкү PKR субстраты болгон eIF2α фосфорлануусун алдын алат жана акырында апоптотикалык клетканын өлүмүнө тоскоол болот.Жыйынтыктап айтканда, биздин иш DARS-AS1 lncRNAны PACT-PKR жолунун жөнгө салуучусу жана ракты дарылоо жана прогноз үчүн потенциалдуу максат катары ачып берет.
Кеңири геномдук профилдик изилдөөлөр рак менен байланышкан жүздөгөн lncRNAларды аныктады.Бирок, алардын функциясы дээрлик белгисиз бойдон калууда56.Рак өрчүшүнө катышкан келечектүү lncRNA талапкерлерин аныктоо үчүн, биз CRISPRi тутумун колдонуу менен SW620 колоректалдык рак клеткасынын линиясында пролиферацияны азайтуу үчүн функцияны жоготкон экранды аткардык (сүрөт 1а).SW480 жана SW620 жоон ичеги рагы клетка линияларынын уникалдуу өзгөчөлүгү, алар бир бейтапта биринчилик жана экинчилик шишиктерден алынган.Бул өнүккөн жоон ичеги рагынын прогрессиясында генетикалык өзгөрүүлөрдү изилдөө үчүн баалуу салыштырууну камсыз кылат.Ошондуктан, биз РНК секвенирлөөнүн жардамы менен колоректалдык рак клеткаларынын линияларынын (SW480 жана SW620) транскриптомдорун талдап чыктык жана жарыяланган адабияттардан кээ бир потенциалдуу функционалдуу lncRNAларды чогулттук.Бул натыйжалардын негизинде, биз терс башкаруу үчүн 971 рак менен байланышкан lncRNAs жана 500 максатсыз sgRNA олиго багытталган 7355 sgRNA олигосун камтыган бириктирилген sgRNA китепканасын иштеп чыктык (Кошумча маалыматтар 1).
CRISPRi системасын колдонуу менен скринингдин схемалык чагылдырылышы.б скринингден кийин сгРНКны байытуу.Туурасынан чекиттүү сызык log2 (бүктөм өзгөртүү) = ±0,58 билдирет.Тик чекиттүү сызык p маанисин көрсөтөт = 0,05.Кара чекиттер максаттуу эмес sgRNAны билдирет (NC катары белгиленген).Кызыл чекиттер DARS-AS1ге багытталган sgRNAлар.Көк чекиттер - LINC00205, мурда сүрөттөлгөн онкогендик lncRNA багытталган sgRNAs.бүктөлгөн өзгөртүү = (нормаланган окуу, 17-күн)/(нормаланган окуу, 0-күн).c DARS-AS1 sgRNA кулатуусу клетканын өсүшүнө тоскоол болгон.Ката тилкелери үч эксперименттин ± стандарттык четтөөсүн билдирет.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 эки куйруктуу Студенттин t-тест.г DARS-AS1 шишиктердин экспрессиясы (TCGA маалыматтар топтому).em BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP жана COAD менен ооругандардын жупташкан нормалдуу жана шишик үлгүлөрүндө DARS-AS1 экспрессиясы (TCGA маалыматтар топтому).p-маанилери жупташкан эки куйруктуу Студенттин t-тестинин жардамы менен алынган.
Плазмидди куруп, лентивирусту таңгактагандан кийин, биз төрт көз карандысыз инфекция экспериментинде dCas9-SW620 колоректалдык рак клеткасынын линиясын жогорудагы китепкана менен трансдукцияладык.Бул инфекциялар үчүн инфекциянын көптүгү (MOI) 0,1-0,3 болгон, бул ар бир клетканы бир гана сгРНК менен трансфекциялоого болорун көрсөтүп турат.18 күндүк in vitro маданиятынан кийин, максаттуу sgRNAs байытуу профили скринингден кийин азайып же көбөйдү, ал эми максаттуу эмес контролдук олигонуклеотиддердин саны алдын ала скрининг профилине салыштырмалуу салыштырмалуу өзгөрүүсүз бойдон калууда, бул биздин максаттуу скрининг өзгөчөлүгүнө ээ экенин көрсөтүп турат. китепкана.Райс.1b жана кошумча таблица 1). LINC00205, мурда өпкө рагы жана боор рагынын прогрессия58,59,60 илгерилетүү үчүн билдирилген, бул скринингдин ишенимдүүлүгүн тастыктаган (сүрөт. 1b) текшерилген (log2 (foldchange) <-0.58, б наркы <0.05). LINC00205, мурда өпкө рагы жана боор рагынын прогрессия58,59,60 илгерилетүү үчүн билдирилген, бул скринингдин ишенимдүүлүгүн тастыктаган (сүрөт. 1b) текшерилген (log2 (foldchange) <-0.58, б наркы <0.05). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию легких жана рака печени58, 59, 60, бул исклюинин (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), 1b). LINC00205, мурда өпкө рагы жана боор рагы58,59,60 илгерилетүү үчүн билдирди, алынып салынды (log2 (бүктөм өзгөртүү) <-0.58, p-баалуу <0.05), бул скринингдин бекемдигин ырастоо (сүрөт. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可可 58,59,60, 被 筛 选 掉 (log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 证实 了 该 筛选 可靠性 (图 1b). Linc00205 之前 被 报道 可可 58,59,60, 被 筛 选 掉 (log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 证实 了 该 筛选 可靠性 (图 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, бул исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05) 1b). LINC00205, мурда өпкө жана боор рагынын прогрессия58,59,60 илгерилетүү үчүн билдирди, алынып салынды (log2 (бүктөм өзгөртүү) <-0.58, р-баасы <0.05), бул скринингдин бекемдигин ырастоо (сүрөт. .1b).
Сыналган бардык lncRNAлардын ичинен DARS-AS1 да скринингден өттү, үч тектеш sgRNA олигонуклеотиддери 18 күндүк маданияттан кийин олуттуу кыскарды, бул бул lncRNAнын кулашы рактын пролиферациясынын азайышына алып келди (сүрөт 1b).Бул натыйжа андан ары DARS-AS1 кулатуучу клеткалардын өсүү темпи контролдук клеткаларга салыштырмалуу эки эсеге кыскарганын (Figure 1c) жана бир нече башка рак түрлөрүнүн мурунку отчетторуна шайкеш келгендигин көрсөткөн колоректалдык рак клеткаларында MTS анализи тарабынан колдоого алынган.: ачык клеткалуу бөйрөк рагы, калкан безинин рагы жана майда эмес клетка өпкө рагы51,52,53,55.Бирок, анын иш-милдети жана молекулярдык механизмдери жоон ичегинин рагы изилденбеген бойдон калууда.Ошондуктан, биз андан ары изилдөө үчүн бул lncRNA тандап алган.
Бейтаптардагы DARS-AS1 экспрессиясын изилдөө үчүн биз Рак Геном Атласынын (TCGA) долбоорунан 10,327 шишик үлгүсүн ар тараптуу талдадык.Биздин натыйжаларыбыз көрсөткөндөй, DARS-AS1 ар кандай шишиктерде, анын ичинде жоон ичеги аденокарциномасында (COAD), бөйрөктүн ачык клеткалуу карциномасында (KIRC) жана бөйрөктүн папиллярдык клеткалык карциномасында (KIRP) дени сак клеткаларда кеңири чагылдырылган жана олуттуу түрдө жогорулаган..Өтө аз (1d-сүрөт жана кошумча сүрөт 1а, б). Жупташкан дени сак/шишик үлгүлөрүн талдоо табарсыктын уротелиалдык карциномасынын (BLCA), бөйрөктүн бөйрөктүн ачык клеткалуу карциномасынын (KIRC), простата безинин аденокарциномасынын (PRAD), өпкөнүн жалпак клеткалуу карциномасынын (LUSC) шишиктеринде DARS-AS1дин кыйла жогору экендигин тастыктады. , жатын корпусунун эндометриялык карциномасы (UCEC), өпкө аденокарциномасы (LUAD), боордун гепатоцеллюлярдык карциномасы (LIHC), бөйрөктүн бөйрөктүн папиллярдык клеткалык карциномасы (KIRP) жана жоон ичегинин аденокарциномасы (COAD) (p мааниси < 0,05) (сүрөт 1e–m) . Жупташкан дени сак/шишик үлгүлөрүн талдоо табарсыктын уротелиалдык карциномасынын (BLCA), бөйрөктүн бөйрөктүн ачык клеткалуу карциномасынын (KIRC), простата безинин аденокарциномасынын (PRAD), өпкөнүн жалпак клеткалуу карциномасынын (LUSC) шишиктеринде DARS-AS1дин кыйла жогору экендигин тастыктады. , жатын корпусунун эндометриялык карциномасы (UCEC), өпкө аденокарциномасы (LUAD), боордун гепатоцеллюлярдык карциномасы (LIHC), бөйрөктүн бөйрөктүн папиллярдык клеткалык карциномасы (KIRP) жана жоон ичегинин аденокарциномасы (COAD) (p мааниси < 0,05) (сүрөт 1e–m) .Жупташкан дени сак / шишик үлгүлөрүн талдоо, ошондой эле табарсык уротелиялык рак (BLCA), ачык клетка бөйрөк жана бөйрөк клеткалуу карцинома (KIRC), простата аденокарцинома (PRAD), өпкө сквамоз клеткалуу карцинома (LUSC) шишиктерде DARS-AS1 бир кыйла жогору экспрессиясын тастыктады., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) жана аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,01e) м) . , Жатындын эндометриялык карциномасы (UCEC), өпкөнүн аденокарциномасы (LUAD), боордун гепатоцеллюлярдык карциномасы (LIHC), бөйрөктүн папиллярдык клеткалык карциномасы (KIRP) жана жоон ичегинин аденокарциномасы (COAD) (p мааниси << 0.05) (сүр. 1e– m) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 了 了 了 了 了 了 了 在 在 在 在 在 在 在 在 在 肾 细胞癌 (KIRC), 前列 腺腺癌 (PRAD), 肺鳞状 中 中显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (UCEC), 肺腺癌 (LAUD), 肝肝 细胞癌 (liC), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (KIRP) 和结肠腺癌 (COAD) (P 值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康 / 肿瘤样本 肿瘤样本 了 了 os os os os os os os os os os, 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 了 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 的 的 中 内膜 显着 更 中 中 中 显着 显着 中 中 中 中 内膜 显着 更 中 中 中 显着 更 中 肺腺癌 中 中 中 中 肺腺癌 中 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 中 显着 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 中 中 中 中 肺腺癌 肺腺癌 中 中 中 肺腺癌 中 肺腺癌 中 中 显着 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌癌 （kirp） （коад） （p 值<0.05）（图1e-m） .дени сак / шишик жуп үлгүлөрүн талдоо DARS-AS1 мындан ары табарсык уротелий карцинома (BLCA), ачык клеткалуу бөйрөк клеткалуу карцинома (KIRC), простата аденокарцинома (PRAD) жана өпкөнүн сквамоз клеткалуу карцинома (LUSC) шишиктердин ролун колдоого алды.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярный карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) жана аденокарциноме толстой кишки (COAD) (015) -m). Жатындын сары рак оорусу (UCEC), өпкө аденокарциномасы (LUAD), гепатоцеллюлярдык карцинома (LIHC), бөйрөктүн папиллярдык клеткалык карциномасы (KIRP) жана жоон ичеги аденокарциномасы (COAD) (б мааниси <0,05) (Figure 1e -m).Чогуу алганда, бул натыйжалар DARS-AS1 ар кандай рак ооруларында кеңири жана жогорку деңгээлде көрсөтүлөрүн көрсөтүп турат.
DARS-AS1 жана DARS (антисенстик жипти коддоочу ген) бир промоуторду бөлүшүп, бири-бирине жанаша жайгашкандыктан, биз DARS эмес, атайын DARS-AS1ди жок кылуу үчүн shRNAны иштеп чыктык (Кошумча 2a,b жана Кошумча таблица 2) .SW620ден тышкары, биз shRNA кулатуунун эффективдүүлүгүн жана функциясын изилдөө үчүн DARS-AS1ди жогорку деңгээлде көрсөткөн дагы үч клетка линиясын колдондук (Кошумча таблица 3).Биздин натыйжаларыбыз иштелип чыккан үч shRNA тең кеминде 80% DARS-AS1 кулатуучу эффективдүүлүккө жетишип, DARS mRNAнын көлөмүнө анча деле таасир этпегенин көрсөттү (Кошумча сүрөт 2c-f).Мындан тышкары, биз бул shRNAs менен DARS-AS1 кулатып олуттуу SW620 (49,7%) жана HCT116 (27,7%), көкүрөк рагы клетка линиясын MBA-MD-231 (53,4%) колоректалдык рак клетка линияларында клетканын өсүшүнө тоскоол деп табылган.) жана HepG2 гепатома клетка линиясы (92,7% кыскартуу), ошондой эле алардын анкерсиз чөйрөлөрдү түзүү жөндөмдүүлүгү (орточо кыскартуу ~ ​​50,8%, 44,6%, 40,7% жана 75,7% клетка линиясы) (сүрөт 2a, b).SW620-жылы колониянын пайда болушун анализдөөнүн натыйжалары DARS-AS1 shRNA олуттуу болжол менен 69,6% га орточо төмөндөшү менен клетканын көбөйүшүнө тоскоол болгонун тастыктады (сүрөт 2c).
SW620, HCT116, MBA-MD-231 жана HepG2 клеткаларында клетканын көбөйүшүнө (а) жана сфероиддик түзүүгө (б) контролдук shRNA жана DARS-AS1 shRNA таасири.c SW620 клеткаларындагы колониянын пайда болушуна контролдук shRNA жана DARS-AS1 shRNA таасири.DARS-AS1 ашыкча SW620 клеткаларынын клетка пролиферациясы (г), spheroid түзүү (e) жана колония түзүү (f).Көрсөтүлгөн маалыматтар үч эксперименттин орточо ± стандарттык четтөөлөрү болуп саналат.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, жана *** p ≤ 0,001 эки куйруктуу Студенттин t-тестине ылайык.
Функцияны жоготуу боюнча изилдөөлөрдү толуктоо үчүн, биз DARS-AS1ди ашыкча экспрессиялоочу SW620 клеткаларын түздүк (Кошумча сүрөт 2g).DARS-AS1 ашыкча экспрессиясы SW620 клеткаларында клетканын өсүшүн (1,8 эсе), анкорсуз сфероиддик түзүүнү (1,4 эсе) жана колониянын пайда болушун (3,3 эсе) көбөйттү (сүрөт 2d-f).Бул жыйынтыкты дагы бир DARS-AS1 билдирүүчү клетка линиясы, A549 аркылуу тастыктадык.DARS-AS1 ашыкча экспрессиясынан улам бул клеткалардын көбөйүшү A549 клеткаларында байкалды (Кошумча сүрөт 2h, i жана Кошумча таблица 3).Чогуу алганда, бул пайда жана жоготуу изилдөөлөр DARS-AS1 in vitro рак клеткаларынын көбөйүшүнө өбөлгө түзөрүн көрсөтүп турат.
DARS-AS1 клетканын пролиферациясын жөнгө салган негизги механизмди изилдөө үчүн, биз анын протеинди байланыштыруучу потенциалдуу өнөктөштөрүн аныктоо үчүн РНКны түшүрүү анализин жүргүздүк.RT-qPCR натыйжалары DARS-AS1дин болжол менен 86,2% SW620 клеткаларынын цитоплазмасында жайгашканын көрсөттү (Кошумча сүрөт 3a).In vitro транскрипцияланган биотинилденген DARS-AS1 же псевдоРНК андан кийин SW620 клетка лизаттары менен инкубацияланган, андан кийин SDS-PAGE бөлүнөт.Кийинки күмүш боёгу DARS-AS1 тартуу үлгүлөрүндө айырмаланган тилке (~ 38 кДа) олуттуу байытылганын, бирок жасалма РНК же шурулардын үлгүлөрүндө эмес экенин көрсөттү (сүрөт. 3a).Бул тилке масс-спектрометрия (MS) менен PKR активдештирүүчү протеин (PACT) катары аныкталган жана андан ары SW620, HCT116 жана HepG2 клетка линияларында иммуноблотинг менен тастыкталган (сүрөт 3a, b).DARS жана ага байланыштуу PACT белокторун - PKR жана TRBP - байытуу, ошондой эле Western Blotting (ВБ) тарабынан РНК анализин колдонуу менен изилденген.Натыйжалар DARS-AS1 РНК менен бул үч протеиндин ортосунда түз өз ара аракеттенүү табылган жок экенин көрсөттү (Кошумча сүрөт 3b).DARS-AS1 жана PACT ортосундагы спецификалык өз ара аракеттенүү РНК иммунопреципитациясынын (RIP) анализи менен дагы тастыкталды, ал DARS-AS1 анти-ПАКТ антителолоруна олуттуу байытылганын, бирок башка башкаруу РНКларына эмес (Figure 3c).DARS-AS1 башка уюлдук компоненттери жок болгон учурда PACT менен түздөн-түз өз ара аракеттенишээрин аныктоо үчүн, тазаланган PACT колдонуу менен in vitro био катмар интерферометрия (BLI) анализи жүргүзүлгөн.Биотин менен белгиленген DARS-AS1 же жасалма РНК стрептавидин (SA) биосенсорлорунда иммобилизацияланган жана андан кийин 1 мкм PACT камтыган кинетикалык буферде инкубацияланган.Белгилей кетсек, PACT DARS-AS1 (KD мааниси ~ 26,9 нМ) менен катуу байланышкан, бирок РНКны туурабайт (3d-сүрөт).Чогуу алганда, бул натыйжалар DARS-AS1 жана PACT ортосунда түз өз ара аракеттенүүнү жана жогорку жакындыгын көрсөтүп турат.
РНК тартуу талдоо DARS-AS1 SW620 клеткаларындагы PACT менен өз ара аракеттенгендигин аныктады.Жогоруда, тиешелүү протеиндердин күмүш боёгу.Төмөнкү иммуноблоттор анти-ПАКТ антителолору менен аткарылды.b РНКны ылдый түшүрүү анализи HCT116 (жогорку) жана HepG2 (төмөнкү) клеткаларында жүргүзүлгөн.PACT байытуу иммуноблотинг аркылуу аныкталган.cRNA иммунопреципитациясынын (RIP) анализдери SW620 клеткаларында көрсөтүлгөн антителолорду колдонуу менен аткарылган.d PACT менен толук узундуктагы DARS-AS1 же контролдук РНКны байланыштыруучу ийри сызыктар био катмар интерферометриясын (BLI) колдонуу менен алынган.РНК стрептавидин биосенсорунда иммобилизацияланган.1 μM PACT бирикмесин өлчөө үчүн колдонулган.e РНКны тартуу анализи биотинилденген толук узундуктагы DARS-AS1 же кесилген (жогорку) аркылуу аткарылган.PACT алынганын көрсөткөн иммуноблот (төмөндө).f Тазаланган желекчеси бар PACT биотинилденген толук узундуктагы DARS-AS1 менен инкубацияланган же in vitro RIP анализи үчүн кесилген (e сыяктуу).Алынган РНК RT-qPCR менен текшерилди.g Ар кандай РНК фрагменттеринин PACT үчүн салыштырмалуу жакындыгы биокатмар интерферометриясынын жардамы менен алынган.Талдоо үчүн 100 нМ РНК жана 1 мкм RAST колдонулган.h In vitro RIP анализдери тазаланган бүтүн же кесилген энбелгиленген PACT колдонуу менен аткарылган.Алынган РНК RT-qPCR менен текшерилди.i DARS-AS1, PACT же экөөнү тең ашыкча экспрессиялаган SW620 клеткаларынын өсүү темпи.j SW620 клеткаларында толук узундуктагы же кесилген DARS-AS1дин ашыкча экспрессиясы клетканын өсүшүнө ар кандай таасир эткен.k Апоптоз анти-PARP антитело менен иммуноблоттоо жолу менен аныкталган.l DARS-AS1 нокауту агым цитометриясы көрсөткөндөй SW620 клеткаларынын апоптозуна түрткү берет.Көрсөтүлгөн маалыматтар үч эксперименттин орточо ± стандарттык четтөөлөрү болуп саналат. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, эки куйруктуу Студенттин t тести менен. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, эки куйруктуу Студенттин t тести менен. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 эки куйруктуу Студенттин t-тест менен. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 эки куйруктуу Студенттин t-тест менен.
Андан кийин PACT бирикмеси үчүн талап кылынган DARS-AS1 аймагын аныктоо үчүн in vitro транскрипциясы аркылуу биотинилденген DARS-AS1 РНКсынын үч фрагменттерин түздүк (сүрөт 3e).РНК анализинин натыйжалары ар бир фрагмент PACT менен өз ара аракеттене аларын көрсөттү, бирок 3′-терминалдык аймак (A3 деп белгиленген 384–768 нуклеотиддер) A1 деп белгиленген 1–384 нуклеотидден көптү көрсөттү (сүрөт 3e).Окшош натыйжалар рекомбинанттык PACT колдонуу менен in vitro RIP анализинде байкалган (Figure 3f).Бул натыйжаларга ылайык, BLI аркылуу иммобилизацияланган РНК фрагменттерин PACT менен байланыштыруу боюнча эксперименттер дагы PACT A3 (384–768 nt) (KD мааниси болжол менен 94,6 нМ) үчүн көбүрөөк жакындыгын көрсөттү, ал эми башка аймактар ​​менен дээрлик эч кандай байланышы жок.(3d-сүрөт).
Биз ошондой эле PACTдагы байланыштыруучу аймактарды карап чыктык.PACT үч функционалдуу доменди камтыйт, алардын экөөсү консервацияланган кош тилкелүү РНК-байланыштуу домендер (dsRBD) жана үчүнчү домен (D3 дайындалган) белоктун өз ара аракеттенүүсүнүн активатору катары иштейт.Ар бир домендин lncRNA байланышуу жөндөмдүүлүгүн изилдөө үчүн биз үч домендин ар бирин жок кылган үч мутацияны иштеп чыктык жана in vitro RIP анализин жүргүздүк.Биздин натыйжалар PACTтин үчүнчү доменин (D3) жок кылуу анын DARS-AS1 менен өз ара аракеттенүүсүн (бүтүлбөгөн PACT менен салыштырганда 0,11 эсеге) башка эки мутацияга (сүрөт 3h) салыштырмалуу азайтканын көрсөттү. D3 DARS менен өз ара аракеттенген.-AC1.Чогуу алганда, бул натыйжалар DARS-AS1 жана PACT ортосундагы өз ара аракеттенүү, биринчи кезекте, DARS-AS1 жана PACTтин D3 доменинин 3' аягы аркылуу болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Биз DARS-AS1 PACT билдирүүсүнө эч кандай таасир этпегендигин жана PACT DARS-AS1ге эч кандай таасир этпегенин белгиледик (Кошумча 3c сүрөт).Андан кийин биз PACT кулатуунун клетканын өсүшүнө таасирин карап чыктык.DARS-AS1ден айырмаланып, PACT кулаганда салыштырмалуу клеткалар 1,5-3 эсе тез өскөн (Кошумча сүрөт 3d).Колония түзүү анализинин натыйжалары PACT менен shRNA дарылоодон кийин клеткалар 2-3 эсе колонияларды түзүшкөнүн көрсөттү (Кошумча сүрөт 3e).DARS-AS1 PACT аркылуу клетканын пролиферациясын жөнгө салат же жокпу, текшерүү үчүн биз PACT, DARS-AS1 же экөөнү тең ашыкча экспрессациялаган SW620 клеткаларын түздүк.PACTтин ашыкча экспрессиясы клетканын көбөйүшүнө олуттуу тоскоол болгонун көрсөттү (Figure 3i).DARS-AS1 ашыкча экспрессиясы клетканын көбөйүшүнө олуттуу көмөк көрсөтсө да, DARS-AS1 жана PACT ашыкча экспрессияланган клеткалардын өсүү темпинде олуттуу айырма болгон эмес.Бул натыйжалар PACT DARS-AS1 ашыкча экспрессиясынан улам көбөйгөн жайылышына каршы тура алат деп көрсөтүп турат.
DARS-AS1дин ар кандай аймактары ар кандай PACT-байланыш жөндөмүнө ээ болгондуктан, биз DARS-AS1 фрагменттеринин ар кандай ашыкча экспрессиясы менен алардын клетканын жайылышына салыштырмалуу таасирин изилдедик.Башка эки фрагменттерге салыштырмалуу, DARS-AS1 3' аягында (384-768 nt), DARS-AS1деги PACT менен байланышкан негизги аймак болгон, клетканын көбөйүшүн стимулдаштыруучу эң жогорку жөндөмгө ээ болгон (сүрөт 3j).Бул жыйынтыктар DARS-AS1дин байланыш жөндөмдүүлүгү менен биологиялык функциясынын ортосундагы оң корреляцияны көрсөтүп турат.
PACT про-апоптотикалык протеин болуп саналат19.Ошондуктан, DARS-AS1дин апоптозго тийгизген таасирин изилдедик.Күтүлгөндөй, DARS-AS1 кулатуусу SW620 клеткаларында PARP бөлүнүшүн олуттуу түрдө көбөйттү жана SW620, HCT116, HepG2 жана MBA-MD-231 клетка линияларында анексин V-оң клеткалардын үлүшүн көбөйттү (сүрөт. 3k).3).3f-h), рак клеткаларында DARS-AS1дин анти-апоптотикалык таасири PACTтин апоптозду жаратуучу функциясына карама-каршы экенин көрсөтүп турат.Чогуу алганда, бул натыйжалар DARS-AS1 онкогендик функциянын механизми PACT функциясына бөгөт коюу аркылуу болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Андан кийин, биз DARS-AS1-PACT бирикмесинин функционалдык кесепеттерин изилдедик.PACT түздөн-түз өз ара аракеттенүү аркылуу PKRди активдештирет, бул eIF2α фосфорлануусун күчөтүп, котормо жок кылууну жана апоптозду жаратат17.Биринчиден, биз DARS-AS1 PACT жана PKRдин уюлдук локализациясына таасир этеби же жокпу, изилдедик.Конфокалдык флуоресценттик микроскопия көрсөткөндөй, PACT жана PKR SW620 клеткаларында 0,72 орточо Пирсон корреляция коэффициенти менен коллокализацияланган.Ошол эле учурда, DARS-AS1 ашыкча экспрессиясы PACT жана PKR ко-локализациясын олуттуу кыскартты (орточо Пирсон корреляция коэффициенти 0.61) (Figure 4a).DARS-AS1 PACT-PKR өз ара аракеттенүүсүн модуляциялай алабы же жокпу, изилдөө үчүн, биз SW620 клетка лизаттарында анти-ПАКТ антитело менен бирге иммунопреципитация (ко-IP) анализин жүргүздүк.PKR жогорку PKR калыбына DARS-AS1 overexpressing клеткалардын lysates кыскарган, ал эми башкаруу клеткаларында анти-PACT менен байытылган (сүрөт. 4b).Тазаланган энбелгиленген PACT жана PKR in vitro протеинди байланыштыруучу анализдер үчүн колдонулган.Демек, DARS-AS1 камсыз кылган, бирок башкаруу РНКсы жок PACT-PKR өз ара аракеттенүүсүн көрсөткөндөр (Figure 4c).Бардык натыйжалар DARS-AS1 PACT жана PKR байланышын үзгөнүн көрсөттү.
Конфокалдык флуоресценттик микроскопиянын жардамы менен DARS-AS1ди ашыкча экспрессиялоочу клеткаларда же PACT жана PKRдин биргелешип локализациясы байкалды.Ядролор DAPI менен боёлгон.Статистикалык жыйынтыктар 16 фотосүрөттөн алынды.b Башкаруу SW620 клеткаларынын клетка лизаттарында же DARS-AS1 ашыкча экспрессияланган клеткаларда анти-PACT антителолорун колдонуу менен бирге иммунопреципитация (ко-IP).c Белгиленген PACT, тазаланган PKR жана DARS-AS1 же жасалма РНК менен in vitro транскрипциясы in vitro протеин менен байланыштыруу анализи үчүн инкубацияланган.Иммунопреципитация үчүн флагга каршы антителолор колдонулган.г Көрсөтүлгөн антителолор менен иммуноблоттор контролдук shRNA же DARS-AS1-shRNA менен трансфекцияланган SW620 жана HCT116 клеткаларында аткарылган, андан кийин сывороттук ачарчылык.e DARS-AS1 экспрессия деңгээли thapsigargin үчүн уюлдук сезгичтигин өзгөрттү.SW620 клеткалары DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ашыкча экспрессия плазмидасы же контролдук плазмида менен трансфекцияланган.Клеткалар 48 саат бою тапсигаргин менен дарыланган жана клетканын жашоо жөндөмдүүлүгү MTS реагентинин жардамы менен аныкталган.f In vitro транскрипцияланган DARS-AS1 же жасалма РНК жана тазаланган PACT in vitro активдештирүү анализи жана иммуноблотту аныктоо үчүн колдонулган.g Бул антителолорду колдонуу менен иммуноблоттор SW620-ctrl клеткаларында (солдо) же PKR мутанттарын ашыкча экспрессиялоочу клеткаларда (оңдо) аткарылган.Бул клеткалар андан кийин контролдук shRNA же DARS-AS1-shRNA менен трансфекцияланган, андан кийин сывороттук ачарчылык.h Flow цитометриясы мутанттык PKRдин инактивациясы SW620 клеткаларында DARS-AS1 менен шартталган апоптоздун ордун толтургандыгын көрсөттү.i Көрсөтүлгөн антителолор менен иммуноблоттор SW620 (солдо) же HCT116 (оң) клеткаларында аткарылган.Контролдук shRNA же DARS-AS1 shRNA менен трансфекцияланган клеткалар сывороткасыз жана 100 нМ PKR C16 ингибитору же DMSO менен толукталган.Масштаб тилкеси = 5 мкм.Көрсөтүлгөн маалыматтар үч эксперименттин орточо ± стандарттык четтөөлөрү болуп саналат.* p ≤ 0,05 эки куйруктуу Студенттин t-тест.
Жалпысынан алганда, PACT PKR17 менен өз ара аракеттенгенден кийин, Thr451де PKR phosphorylation индукцияланышы мүмкүн.Биздин натыйжалар PKR фосфорлануусунун деңгээли DARS-AS1 кулатуучу клеткаларда сары суунун ачарчылыктан кийин бир кыйла жогорулагандыгын көрсөттү (4d жана кошумча сүрөт 4a).Демек, биз негизги PKR субстраты болгон eIF2α фосфорлануусу да DARS-AS1 shRNA тарабынан кыйла көбөйгөнүн таптык (4d-сүрөт жана кошумча сүрөт 4a).Тапсигаргин - бул ER стрессору, ал ERден Ca2+ бөлүп чыгарат.thapsigargin менен дарылоо андан ары PKR менен өз ара жана активдештирүү PACT туюнтма жана жандандыруу, eIF2α phosphorylation 18,61 жогорулатуу менен апоптоз алып баруучу билдирди.Бул жерде биз DARS-AS1 клеткаларга PACT/PKR жолун бөгөт коюу менен стрессти жеңүүгө жардам бере аларын изилдөө үчүн PACT/PKR жолунун стимулятору катары thapsigargin колдондук.Биз DARS-AS1 экспрессиясынын деңгээли thapsigargin үчүн клетканын каршылыгы менен оң корреляцияланганын байкадык.DARS-AS1ди ашыкча экспрессиялаган SW620 клеткалары thapsigargin менен дарыланганда жакшыраак жашап калышты, ал эми DARS-AS1 кулап түшкөн клеткалар сезгич болуп калды (сүрөт 4e).Бул натыйжаларга ылайык, DARS-AS1 ашыкча экспрессиясы тапсигаргин менен шартталган PKR фосфорлануусун азайткан (Кошумча сүрөт 4b).Ал эми, thapsigargin менен дарылоодон кийин, PKR жана eIF2α контролдоочу клеткаларга салыштырмалуу DARS-AS1 кулатуучу клеткаларда көбүрөөк фосфорланышкан (Кошумча сүрөт 4b).Кызыктуусу, тапсигаргин DARS-AS1 экспрессиясын дозага көз каранды кылып жаратты, бул DARS-AS1дин стресске каршы функциясын көрсөтүшү мүмкүн (Кошумча сүрөт 4c).Мындан тышкары, биз бул байкоолорду ырастоо үчүн in vitro активдештирүү анализдерин жүргүздүк.Кыскача айтканда, PKR анти-PKR антителосун колдонуу менен клетка лизаттарынан тазаланып, андан кийин рекомбинантты PACT жана in vitro транскрипцияланган DARS-AS1 менен инкубацияланган.Ферменттик реакциядан кийин WB жардамы менен фосфо-ПКР аныкталган.Биздин натыйжалар PKR phosphorylation олуттуу DARS-AS1 тарабынан тоскоол болгон, бирок башкаруу РНК (Figure 4f) тарабынан эмес экенин көрсөттү.Бул in vitro жана in vivo натыйжалары DARS-AS1 PACT-арачылыгы PKR активдештирүү тоскоол экенин көрсөтүп турат.Ошол эле учурда, биз DARS-AS1 (Figure 4f) катышуусунда PACT калыбына төмөндөшүн байкадык.Бул натыйжа in vitro протеинди байланыштыруучу анализдин натыйжалары менен шайкеш келет (Figure 4c) жана PACT-PKR бирикмеси үчүн DARS-AS1дин бөгөттөө функциясын дагы бир жолу сүрөттөйт.
PACTтин D3 домениндеги Ser246 жана Ser287 уюлдук стресс астында PKR активдештирүү үчүн талап кылынат.Аланинге эки серин калдыктарын алмаштыруу мутантты PACT (mutD) берди, ал стресс жокто PKRди активдештирип, аланинди алмаштыруу (mutA) протоколду өзгөрттү.Биз DARS-AS1 менен түздөн-түз байланышта бул домендин маанилүүлүгүн көрсөткөндүктөн, биз бул калдыктар DARS-AS1 менен өз ара аракеттенүүгө катыша алар-албасын текшерүү үчүн бул эки PACT мутанттарын түздүк.Кызыктуусу, эки мутант тең DARS-AS1 менен байланышуу жөндөмүн жоготкон (Кошумча сүрөт 4d), бул DARS-AS1 менен эффективдүү өз ара аракеттенүү үчүн PACT протеининин толук түзүлүшү талап кылынышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Мындан тышкары, биздин натыйжаларыбыз ошондой эле DARS-AS1-shRNA менен шартталган клетканын пролиферациясын бөгөт коюу үстөмдүк кылган терс PACT мутантын (PACTmutA) же басымдуу терс PKR мутантынын (PKRmut) ашыкча экспрессиялоо менен жарым-жартылай калыбына келтирилиши мүмкүн экенин көрсөтүп турат (Кошумча сүрөт 4e. e).Доминант-терс PKR мутанттарынын ашыкча экспрессиясы DARS-AS1 кулатуусу менен шартталган PKR phosphorylation, ошондой эле кан сары суусу жок клеткаларда eIF2α phosphorylation кыскарган (сүрөт. 4g).Андан да маанилүүсү, DARS-AS1 кулатуусунан улам пайда болгон апоптотикалык клеткалардын үлүшү PKRmutти ашыкча экспрессиялаган клеткаларда да азайган (сүрөт 4h жана кошумча сүрөт 4g).PKR киназынын активдүүлүгүнүн бөгөт коюусу DARS-AS1 функциясын да начарлатат, анткени натыйжалар көрсөткөндөй, DARS-AS1 кулатуу PKR жана eIF2α фосфорлануусун сейрек шарттаган PKR-спецификалык C16 ингибитору менен дарыланганда (сүрөт 4i жана Кошумча 4h).).Чогуу алганда, биздин натыйжалар DARS-AS1 PACT-арачылыгы PKR жандантууга бөгөт коюу менен, жок эле дегенде, жарым-жартылай, клетканын көбөйүшүнө өбөлгө түзөт.
DARS-AS1дин шишик пайда кылуудагы ролун андан ары изилдөө үчүн биз чычкандын ксеногрант моделин колдонуу менен in vivo эксперименттерди жүргүздүк. Натыйжалар көрсөткөндөй, DARS-AS1дин кулашы чычкандарда шишиктин өсүшүн кескин төмөндөткөн (р мааниси <0,0001) (сүрөт 5а). Натыйжалар көрсөткөндөй, DARS-AS1дин кулашы чычкандарда шишиктин өсүшүн кескин төмөндөткөн (р мааниси <0,0001) (сүрөт 5а). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Натыйжалар DARS-AS1 кулатуусу чычкандарда шишиктин өсүшүн кескин төмөндөтөт (p мааниси <0.0001) (Figure 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Натыйжалар DARS-AS1 кулатуусу чычкандарда шишиктин өсүшүн кыйла азайтканын көрсөттү (p мааниси <0.0001) (Figure 5a).Ошентип, DARS-AS1 кулатуу тобунда шишиктин орточо көлөмүнүн болжол менен 72,9% га жана шишик массасынын орточо көлөмүнүн 87,8% га төмөндөшү байкалган (Figure 5b-d).Бул жыйынтыктар күчтүү DARS-AS1 олуттуу шишик өсүшүнө өбөлгө болот деп көрсөтүп турат in vivo.
Жылаңач чычкандардын колоректалдык онкогенезине DARS-AS1 жарнамасынын таасири.Өсүү ийри сызыктары (а), шишик өлчөмү (б), салмагы (c) жана шишик сүрөттөрү (г) көрсөтүлгөн.Ката тилкелери ±SEMди билдирет. n = 10. ****p < 0,0001, эки куйруктуу Студенттин t тести боюнча. n = 10. ****p < 0,0001, эки куйруктуу Студенттин t тести боюнча. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 эки куйруктуу Студенттин t-тест.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0,0001 эки куйруктуу Студенттин t-тест.е Каплан-Мейер DARS-AS1 экспрессиясынын деңгээли менен UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM жана LGG менен ооругандардын жалпы жашоосу ортосундагы байланышты талдады.бейтаптар DARS-AS1 билдирүү жогорку денгээлде жогорку 50% болгон;бейтаптардагы DARS-AS1 туюнтмасынын төмөн деңгээли ылдыйкы 50% ды түзгөн.p-маанилери журнал даражасы тести аркылуу аныкталган.DARS-AS1 PACT-PKR жолун жана шишиктин өсүшүн жөнгө салган сунушталган модель.
DARS-AS1 клиникалык таасирин жакшыраак түшүнүү үчүн, биз анын туюнтма жана бейтаптын аман ортосундагы байланышты карап чыктык.TCGA маалыматтар топтомун талдоо менен, биз жогорку DARS-AS1 экспрессиясы uveal меланома (UVM), бөйрөк хромофобия (KICH), бөйрөктүн папиллярдык клетка карциномасы (KIRP), мезотелиома (MESO), мультиплекс менен байланыштуу экенин таптык.Төмөнкү жашоо glioblastoma morphosis (GBM) жана төмөнкү даражадагы мээ glioma (LGG) менен ооруган бейтаптар менен олуттуу байланыштуу болгон (Figure 5e).Бул натыйжалар DARS-AS1 клиникалык шишик прогрессинде маанилүү ролду ойной алат жана бир нече рак мүмкүн болуучу алдын ала биомаркер болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Бул изилдөөдө, масштабдуу CRISPRi функционалдуу скринингди колдонуп, биз DARS-AS1 lncRNA эки негизги стресске жооп берүүчү PACT жана PKRди жөнгө салуу менен рак клеткасынын стрессин жеңе турганын аныктадык.PACT менен түздөн-түз өз ара аракеттенүү менен, DARS-AS1 PACT-арачылыгы PKR активдештирүүсүнө тоскоол болуп, ошону менен апоптотикалык клетканын өлүмүнө жол бербөө жана клетканын көбөйүшүнө көмөктөшөт (сүрөт 5f).DARS-AS1дин жогорулашы рактын бир нече түрлөрүндө байкалган, бул анын стресстик шарттарда рак клеткаларынын жашоосуна көмөктөшүү функциясы рактын бир нече түрлөрүнө кеңири колдонулушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
PACT PKR активатор протеин катары аныкталган жана PACT-арачылыгы PKR активдештирүү транскрипцияны, которууну, апоптозду жана башка маанилүү уюлдук процесстерди62 жөнгө салуу аркылуу стресстик реакцияларда маанилүү ролду ойнойт.Ондогон жылдар бою PACT-PKR каскадынын рак оорусуна мүнөздүү жөнгө салууну түшүнүүгө аракеттер жасалды.Бул жерде биздин изилдөө рак клеткаларында PACT-PKRди клеткалык lncRNA DARS-AS1 аркылуу жөнгө салуунун башка механизмин ачып берди, ал PACT менен түздөн-түз байланышат, PACT-PKR өз ара аракеттенүүсүн бөгөттөйт, PKR активдештирүүсүнө жана eIF2α фосфорлануусуна бөгөт коёт, ошону менен стресстен келип чыккан апоптозду жана рактын жайылышын стимулдайт.клеткалар.Бул ачылыш рак прогноздору жана терапиясы үчүн мүмкүн болуучу lncRNA максаттарына жарык чачат.
Биздин маалыматтар көрсөткөндөй, DARS-AS1 кулатылышы phosphorylated PKR жана eIF2α бир кыйла көбөйүшү менен кан сары суусунун ачарчылыкка клеткаларды сезгич кылат.Бул жыйынтыктар DARS-AS1 PACT/PKR активдүүлүгүн бөгөт коюу менен катаал шарттарда рак клеткаларынын жашоосуна өбөлгө түзөт деп эсептейт.Бир нече башка коддолбогон РНКлар, мисалы, ASPACT жана nc886, ошондой эле PACT/PKR огунда PACT48 mRNAны төмөндөтүп же PKR49,50,64 менен байланышуу аркылуу автофосфорланууну жөнгө салышат.Алардын арасында DARS-AS1 PACT-PKR бирикмесин бузуучу катары иш алып барат.Бул изилдөө PACT/PKR огу жөнгө салуу жана стресс жооптор lncRNAs ролу биздин түшүнүгүбүздү байытат.
PACT үч өзүнчө доменди камтыйт.Биринчи эки dsRBDдин ар бири PACTтин PKRге жогорку жакындык байланышына жетишүү үчүн жетиштүү, ал эми үчүнчү домен (D3) PKRди in vitro жана in vivo активдештирүү үчүн талап кылынат.Биздин изилдөө DARS-AS1 артыкчылыктуу D3 домен менен өз ара көрсөттү (сүрөт. 3h).lncRNA (768 нуклеотиддер) чоң өлчөмүн эске алуу менен, DARS-AS1 D3 менен байланышы физикалык жактан dsRBD жана PKRдин PACT доменинин ортосундагы өз ара аракеттенүүнү бөгөттөп, ошону менен PACT жана PKR ассоциациясын бөгөттөй алат.D3деги Ser246 жана Ser287ди аланин же аспартат менен алмаштырган PACT чекитинин мутациялары анын DARS-AS1 менен байланышуу жакындыгын бузуп, алардын бирикмесинде D3дин жалпы структуралык жана электрдик касиеттеринин маанилүүлүгүн көрсөттү.Бул механизмдин дагы деталдары келечекте так биохимиялык анализди жана жогорку резолюциядагы PACT структуралык анализин колдонуу менен талап кылынат.
Мурунку изилдөөлөр DARS-AS1 бир нече механизмдер51,52,53 аркылуу клетканын көбөйүшүнө өбөлгө түзөт деп билдирди.Бир мисалда, изилдөөчүлөр DARS-AS1 бөйрөк рак клеткаларында miP-194-5p бутага алуу менен анын антисенс белок-коддоочу DARS генин жөнгө салганын байкашкан.Бирок, бул изилдөөдө, DARS-AS1 кулатуусу рактын бир нече түрлөрүндө, анын ичинде жок дегенде ичеги, эмчек жана боор рактарында DARS транскрипциясына анча деле таасир эткен эмес.lncRNAs клетканын жана кыртыштын өзгөчө экспрессия үлгүлөрүн көрсөткөндүктөн, рактын түрлөрү боюнча функциялык механизмдер сакталбашы мүмкүн, бул биздин байкоолорубуз менен ар кандай рактын мурунку бааларынын ортосундагы дал келбестикке өбөлгө түзөт.Ар кандай физиологиялык жана патологиялык процесстердин конкреттүү механизмдерин ачыктоо үчүн атайын изилдөөлөр керек.
Клиникалык маалыматтарды талдоо шишиктерде DARS-AS1 экспрессиясы рак менен ооругандардын жашоосу менен тескери байланышта экенин көрсөттү, бул DARS-AS1/PACT/PKR огунун рактын алдын алуудагы маанилүүлүгүн баса белгилейт.Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөө DARS-AS1 PACT/PKR сигнал огунун жөнгө салуучу экенин көрсөтүп турат, рак клеткаларынын көбөйүшүнө өбөлгө түзөт жана стресске жооп кайтаруу учурунда апоптозду бөгөттөйт, бул изилдөөнүн дагы бир линиясын камсыз кылат жана келечектеги потенциалдуу дарылоону изилдөө үчүн кызыкчылык туудурат. .
Адамдын SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 жана HEK293T клетка линиялары Кытайдагы Улуттук Cell Line Ресурстук Инфраструктурасынан алынган.Бардык клеткалар DMEM чөйрөсүндө (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) жана 1% пенициллин-стрептомицин (Thermo Fisher Scientific) менен толукталган 37 ° C, 5% CO2 сакталган.инкубатор.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Анти-ПКР, Абкам (ab184257);Анти-ПКР (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));анти-eIF2α (phosphorus S51), Abcam (ab32157);анти-PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);анти-β-тубулин, CST (2128);кадимки чычкан IgG, CST (5415S);кадимки коён IgG, CST (2729S).Антителолор 1:1000 PBSTде Western blotting үчүн жана 1:100 IP үчүн суюлтулган.
sgRNAs CRISPR-ERA66 деп аталган жалпыга жеткиликтүү куралды колдонуу менен иштелип чыккан.Биз sgRNA иштеп чыгуу үчүн демейки инструменттин параметрлерин жана 3 кб аймагындагы sgRNA байланышуу сайттарын эсептеген алгоритмди колдондук.TSS борборлоштурулган.sgRNA олигонуклеотиддеринин бассейндери CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) компаниясында синтезделди жана гумандаштырылган pgRNA плазмидаларына клондолду (Addgene #44248).Жалпысынан 12 мкг топтолгон гумандаштырылган pgRNA плазмиди, 7,2 мкг psPAX2 (Addgene #12260) жана 4,8 мкг pMD2.G (Addgene #12259) 5 x 106 HEK293Tге 10gent disfect DNA Трансфекциясы менен бирге трансфекцияланган. клеткалар (CWBIO, Пекин, Кытай) өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык.Вирусту камтыган супернатанттар трансфекциядан кийин 48 жана 72 сааттан кийин чогултулуп, 0,45 мкм фильтр аркылуу чыпкаланган.Скрининг үчүн dCas9/KRAB синтез протеинди билдирген SW620 клеткалары вирустун трансдукциясы аркылуу алынган.Өзгөртүлгөн SW620 клеткалары 0,1-0,3 МИде төрт көз карандысыз инфекция экспериментинде вирус китепканасы менен жуккан жана 2 күн бою 2 мкг/мл пуромицин (Сигма, Сент-Луис, МО) менен үлгү алынган.Андан кийин, клеткалар скрининг үчүн 500 клетка/sgRNA минималдуу китепкана камтуу менен in vitro 18 күн бою өстүрүлгөн.
Геномдук ДНК QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Германия; 51183) нускамаларына ылайык алынган.Жалпысынан китепкананы куруу үчүн биологиялык кайталоодо 100 мкг геномдук ДНК колдонулган.sgRNA аймагы ПТРдин эки айлампасы менен күчөтүлгөн жана штрих-код менен байланышкан.
ПТР продуктулары NucleoSpin® гели жана ПЦР тазалоочу комплекти (MACHEREY-NAGEL, Дюрен, Германия; 740609.250) менен тазаланган жана Qubit™ HS эки тилкелүү ДНКны аныктоочу комплект (Thermo Fisher Scientific; Q32854) менен сандык бааланган.
МТС анализи клетканын көбөйүшүн өлчөө үчүн колдонулган.Клеткалар 2000 клетка/скважинанын баштапкы тыгыздыгында 96 көзөнөктүү плиталарга себилген.Клеткалардын салыштырмалуу саны күн сайын көрсөтүлгөн убакытта жалпы 4-6 күн бою өлчөнгөн.Ар бир скважина үчүн 20 мкл МТС реагенти (Промега) 100 мкл DMEM менен суюлтулуп, клеткалар менен 37°C температурада 4 саат инкубацияланган, андан кийин OD490 өлчөнгөн.
Сфералардын пайда болушун талдоо аркылуу анкерсиз өсүү мүмкүнчүлүгү табылган.Кыскача айтканда, shRNA DARS-AS1 же контролдук shRNA менен трансфекцияланган 2000 клетка ар бир 4 күндө орто өзгөрүү менен ультра төмөн тиркеме микропластинкаларында (Корнинг) өстүрүлгөн.Сфероиддер 14 күндөн кийин саналган.DARS-AS1 ашыкча экспрессия плазмидасы же контролдук плазмид менен трансфекциланган 500 клетка күчөтүү анализи үчүн колдонулган, антпесе ыкма өзгөргөн жок.
РНК T7 РНК полимераза жана биотин-16-UTP (Roche 1138908910) аркылуу Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) көрсөтмөлөрүнө ылайык транскрипцияланган.Бул жерде колдонулган праймерлер кошумча 4-таблицада келтирилген.
Протеинди коддоочу PACT же PKR аймактары pET15b (Addgene #73619) клондолуп, BL21(DE3) болуп өзгөртүлгөн.Бактериялар ампициллин менен камсыздалган LBде түнү бою инкубацияланган жана андан кийин жаңы LB менен 100 эсе суюлтулган.чөйрөнүн OD600 0,8 жеткенде, 1 мм IPTG протеин туюндуруу үчүн кошулду.Түнү бою акырын чайкап (20°Cде 250 айн/мин) инкубациялоодон кийин клетканын гранулдары центрифугалоо жолу менен чогултулду (4000 айн/мин, 10 мин, 4°C).Лизис буферинде (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) клетканын гранулдарын кайра суспендеңиз жана 30 мүнөт музда инкубациялаңыз, андан кийин sonicate (15 мин, 5 с күйгүзүү/өчүрүү, музда) жана центрифугалоо (13,00) rpm)., 30 мин, 4°С).Андан кийин үстүнкү зат Ni-NTA чайырына (QIAGEN) 3 жолу 4°C жүктөлүп, 4 жолу жуу буфери (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM имидазол, 250 mM NaCl) менен жууп, жалпысынан 3 жолу элюталанган. 10 мл элюент буферинин (50 мМ Tris, pH 8.0, 250 мМ NaCl, 300 мМ имидазол).Тазаланган протеин WB аркылуу аныкталды жана концентрация Qubit™ протеин анализинин комплекти (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) менен аныкталды.
RIP анализдери мурда сүрөттөлгөндөй, өзгөртүүлөр менен аткарылган.Кыскача айтканда, 1x RIP буфери (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin рибонуклеаза ингибитору (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, протеаза) xtostatic lises x10tail (Roche, 1 мМ DTT) жана центрифуга 13,000 айн / мин 4 °C 15 мүнөт.Андан кийин супернатант 5 мкг анти-ПАКТ антителосу (Abeam) же IgG (CST) менен конъюгацияланган протеин A+G магниттик мончоктору (Миллипор) менен инкубацияланган.Мончоктор 5x RIP буфери менен 5 жолу жууп, андан кийин протеиназа K (NEB) менен сиңирилди.РНК Trizol менен алынган жана RT-qPCR менен аныкталган.Примерлер 5-кошумча таблицада берилген.
In vitro RIP анализи өзгөртүлгөн стандарттык RIP анализ протоколуна ылайык аткарылган.Жалпысынан 5 pmol in vitro транскрипцияланган РНК RIP буфери менен 1 жолу суюлтулган жана 65°C температурада 5 мүнөт инкубациялоо жолу менен күйдүрүлгөн, андан кийин бөлмө температурасына чейин жай муздатылган.Жалпысынан 5 pmol бузулбаган же мутацияланган желекчеси бар PACT протеиндери E. coliден тазаланган.Ренатурацияланган РНК менен 2 саат 4°Cде инкубациялаңыз жана антифлаг IP үчүн RIP анализи үчүн жогорудагы процедураны аткарыңыз.
РНК узартуу талдоо үчүн, 1 × 107 клеткалар 1xRIP буфер менен лизис болгон.13,000 айн / мин 4 ° C 15 мүнөт центрифугалоо кийин, супернатант 4 ° C 2 саат бою стрептавидин магниттик мончоктор (Бекман) 30 мкл менен алдын ала дарылоо.Андан кийин тазаланган лизат ачыткы тРНКсы менен камсыздалып, 4°Cде түнү бою 40 pmol ренатурацияланган РНК менен инкубацияланган, андан кийин дагы 2 саатка жана BSA менен тосулган 20 мкл жаңы стрептавидин магниттик мончоктору кошулган.Жуу кадамы 5x RIP буфери менен 4 жолу жана 1x RIP буфери менен 4 жолудан турган.Тиешелүү протеиндер биотин элюция буфери (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) менен элюцияланган жана NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) боюнча бөлүнгөн.Күмүшкө боёгондон кийин (Beyotime Biotechnology), кээ бир тилкелер MS тарабынан кесилип, талданган.
Co-IP талдоо PACT жана PKR ортосундагы өз ара аракеттенүү үчүн жүргүзүлгөн.Кыскача айтканда, супернатанттык лизаттар 1 x RIP буферинде 1 x 107 лизиденген клеткаларды инкубациялоо, андан кийин 13000 айн/мин центрифугалоо аркылуу 4°Cде 15 мүнөткө даярдалды.Лизаттар протеин A + G магниттик мончоктору менен жүктөлүп, 5 мкг анти-ПАКТ антитело менен конъюгацияланган жана акырын түнү 4°Cде айланган.Мончоктор 3 жолу 5×RIP буфери менен, эки жолу 1×RIP буфери менен жуулчу жана 1×SDS буфери менен элюталанган.Калыбына келтирилген белок SDS-PAGE гели менен анализденип, ВБ тарабынан аныкталган.
Эки пмоль желекчелүү PACT жана 1 пмоль ПКР E. coliден тазаланды.1 × RIP буферинде суюлтуңуз жана 4 °C температурада 2 саат бою 10 pmol ренатурацияланган РНК менен инкубациялаңыз.Андан кийин, алар кошумча эки саатка протеин A+G магниттик мончоктор менен конъюгацияланган анти-белгиленген антитело менен инкубацияланган.Мончоктор андан кийин 1x RIP буфери менен төрт жолу жуулчу жана 1x SDS буфери менен элюталанган.Натыйжада PACT жана PKR ДБ тарабынан аныкталган.